基因Ⅶ型NDV强毒株反向遗传系统的建立及其应用研究

发布时间：2017-05-13 01:08

  本文关键词：基因Ⅶ型NDV强毒株反向遗传系统的建立及其应用研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：新城疫(Newcastle Disease, ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)引起的禽类的一种急性、高度接触性传染病。世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须报告的传染病,我国农业部在动物疫病病种目录中将其列为一类动物疫病。疫苗免疫是防控该病的主要手段,但目前使用的疫苗株与流行株在同源性上存在一定差异,这使得一些免疫鸡群仍然存在ND的爆发。我国NDV的流行株以基因VIM型为主。本实验室多年来一直从事NDV的流行病学调查工作,在各类鸡群中分离的NDV强毒均属于基因Ⅶd型。这些毒株的主要免疫原性蛋白F和HN的同源性分别为96%～100%和93%～100%,相比之下这些毒株与疫苗株La Sota的F和HN蛋白的同源性仅为87.4%～88.8%和86.7%～88.8%。 NDV SG10株属于基因Ⅶd型强毒株,是本实验室于2010年自爆发NDV的免疫鸡群中分离获得。前期的研究表明SG10具有较好的繁殖特性和免疫原性。其HN和F蛋白与其他基因Ⅶ型毒株的同源性分别在96.7%-99.7%和96.2%99.8%之间,与常用疫苗株La Sota的同源性分别为87.9%和88.3%。本研究首先构建了SG10株的感染性克隆,通过对拯救病毒rSG10的生物学特性分析表明,重组病毒rSG10保留了与亲本毒SGI0相似的生物学特性。随后,我们通过该反向遗传平台对SG10株NP基因的5’非编码区6nt进行了缺失,构建了突变株SG10-6bp。与原毒株SG10相比,突变株SG10-6bp的生物学特性和致病力均未发生明显变化,表明NP基因的5’非编码区的6nt并不影响NDV毒力。随后,我们对SG10的F蛋白裂解位点处的氨基酸进行了突变,使其在序列上与弱毒La Sota相同,构建了突变株aSG10。与亲本毒相比,aSG10的毒力明显下降,其毒力与疫苗株LaSota相似,这表明F蛋白裂解位点是决定NDV毒力的主要因素。在此基础上,我们将致弱毒aSG10改造成为了外源蛋白表达载体。我们选择将外源基因插入在P与M之间,分别以绿色荧光蛋白和传染性支气管炎病毒(IBV)S1基因作为报告基因,构建了重组病毒aSG10-EGFP和aSG10-S1,结果表明外源基因EGFP和S1蛋白均获得了表达,这说明致弱株aSG10可以作为外源基因表达载体。 为了验证致弱株aSG10作为疫苗株的可行性,我们对aSG10进行了1日龄雏鸡免疫试验,免疫鸡在观察期内无明显的临床症状,同时剖检观察和病理组织学检查也表明aSG10对雏鸡的各个组织和器官均未造成明显的损伤,这表明aSG10作为疫苗株具有良好的安全性。随后,我们对免疫3周的动物进行了强毒株SG10的攻毒试验,结果显示aSG10株免疫组未出现明显的临床症状,病理剖检观察和病理组织学检查也表明aSG10很好地保护了免疫动物。对免疫后的排毒情况进行检测也表明,aSG10能更有效地阻止攻毒后的动物向外界排毒。同时,使用SG1O作为抗原进行HI检测表明,aSG10免疫组的HI抗体水平较La Sota免疫组高一个滴度,表明aSG10能刺激机体产生与强毒株SG10更匹配的免疫反应。
【关键词】：新城疫 反向遗传 疫苗株
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-11
• 中英文对照表11-13
• 第一章 绪论13-27
• 1.1 新城疫病毒的概述13
• 1.2 新城疫病毒的分类和理化特性13-14
• 1.3 新城疫病毒基因组的结构14-15
• 1.4 NDV编码的蛋白及其功能15-18
• 1.5 新城疫病毒的复制与致病性18-20
• 1.6 新城疫病毒的分子流行病学20-21
• 1.7 新城疫病毒疫苗学的概况21-22
• 1.8 新城疫病病毒的反向遗传学及其应用22-25
• 1.9 本研究的目的和意义25-27
• 第二章 NDV SG10株反向遗传系统的建立27-46
• 2.1 引言27-28
• 2.2 材料和方法28-37
• 2.2.1 病毒和细胞28
• 2.2.2 质粒和菌株28
• 2.2.3 SPF鸡胚和SPF鸡28
• 2.2.4 主要试剂和仪器28-29
• 2.2.5 病毒的纯化29
• 2.2.6 病毒序列的测定29-31
• 2.2.7 辅助质粒和微基因组的构建31-33
• 2.2.8 辅助质粒和微基因组的功能鉴定33
• 2.2.9 全长cDNA克隆质粒的构建33-35
• 2.2.10 病毒的拯救35-36
• 2.2.11 拯救病毒的鉴定36
• 2.2.12 拯救病毒的致病性分析36
• 2.2.13 拯救病毒的生长特性分析36-37
• 2.3 结果37-44
• 2.3.1 NDV SG10株序列的测定和分析37-40
• 2.3.2 辅助质粒和微基因组的功能鉴定40-41
• 2.3.3 全长cDNA克隆质粒的构建41-42
• 2.3.4 NDV SG10株的拯救与鉴定42-43
• 2.3.5 拯救病毒生物学特性的测定43
• 2.3.6 拯救病毒的生长特性的分析43-44
• 2.4 讨论44-45
• 2.5 小结45-46
• 第三章 应用反向遗传系统对NDV SG10株进行改造46-63
• 3.1 引言46
• 3.2 材料和方法46-52
• 3.2.1 病毒、质粒和细胞46-47
• 3.2.2 构建SG10株NP基因5’端缺失6bp的突变株47-48
• 3.2.3 突变株rSG10-6bp的生物学特性分析48
• 3.2.4 构建SG10株F蛋白裂解位点突变的病毒株48-49
• 3.2.5 突变株aSG10生物学特性分析49-50
• 3.2.6 表达绿色荧光蛋白的重组NDV的构建50-51
• 3.2.7 突变株aSG10-EGFP生物学特性分析51
• 3.2.8 表达IBV S1蛋白重组NDV的构建51-52
• 3.2.9 突变株aSG10-S1生物学特性分析52
• 3.3 结果52-60
• 3.3.1 SG10株NP基因5’端缺失6bp的突变株的构建52-53
• 3.3.2 突变株rSG10-6bp生物学特性分析53-54
• 3.3.3 拯救病毒的生长特性的测定54
• 3.3.4 构建SG10株F蛋白裂解位点突变的病毒株54-55
• 3.3.5 突变株aSG10生物学特性分析55-56
• 3.3.6 拯救病毒的生长特性的测定56
• 3.3.7 表达绿色荧光蛋白重组NDV的构建56-57
• 3.3.8 突变株aSG10-EGFP生物学特性分析57-58
• 3.3.9 拯救病毒的生长特性的测定58
• 3.3.10 表达IBV S1蛋白重组NDV的构建58-59
• 3.3.11 突变株aSG10-S1生物学特性分析59-60
• 3.3.12 拯救病毒的生长特性的测定60
• 3.4 讨论60-61
• 3.5 小结61-63
• 第四章 重组病毒aSG10株的免疫原性评价63-76
• 4.1 引言63
• 4.2 材料和方法63-65
• 4.2.1 病毒、质粒和细胞63-64
• 4.2.2 致弱株aSG10的安全性和免疫原性鉴定64-65
• 4.2.3 致弱株SG10的攻毒保护试验65
• 4.3 结果65-74
• 4.3.1 安全性检测65-70
• 4.3.2 攻毒保护试验70-74
• 4.4 讨论74-75
• 4.5 小结75-76
• 第五章 结论76-77
• 第六章 创新点77-78
• 参考文献78-85
• 附录85-95
• 致谢95-97
• 作者简介97

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 林健;刘月焕;韩春华;马明;刘永宏;潘洁;;新城疫疫苗对近年流行毒株的保护作用[J];安徽农业科学;2009年23期

2 黄勇,万洪全,刘红旗,吴艳涛,刘秀梵;鹅源新城疫病毒ZJ1株全基因组的序列测定[J];病毒学报;2003年04期

3 孙敏华;胡奇林;;新城疫病毒分子流行病学研究进展[J];动物医学进展;2010年12期

4 金仕强;孟春春;仇旭升;于圣青;丁铲;左之才;;ClassⅠ新城疫病毒概述[J];动物医学进展;2012年04期

5 俞宁;张兆敏;岳华;;新城疫病毒HN基因功能结构域的原核表达[J];中国畜牧兽医;2011年08期

6 武发菊;刘学荣;尚勇良;安芳兰;董文教;宋玉霞;董金杰;陈苗苗;牟克斌;;新城疫疫苗的研究进展[J];中国畜牧兽医;2011年10期

7 何羽婷;巩艳艳;赵鹏;崔治中;;抗体选择压作用下新城疫病毒HN和F基因的演化及其抗原性变异的比较分析[J];病毒学报;2012年05期

8 陈云霞;刘华雷;管峰;郑东霞;赵云玲;王志亮;;Ⅰ类新城疫病毒NDV08-004株病毒拯救体系的建立[J];病毒学报;2012年05期

9 任涛;敖艳华;曹伟胜;张桂红;罗开健;徐成刚;廖明;;我国部分地区近年来新城疫病毒流行株分子生物学特征的研究[J];华南农业大学学报;2006年03期

10 苏长青;卢艳敏;孙焕顷;周文杰;韩九皋;;新城疫病毒NP蛋白的分子生物学特征及其功能[J];江苏农业科学;2009年06期

  本文关键词：基因Ⅶ型NDV强毒株反向遗传系统的建立及其应用研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：361249