线粒体内氨基酸代谢调控其它代谢途径的机制研究

发布时间：2022-07-19 13:21

　　线粒体是细胞中的能量工厂,也是细胞中多种代谢过程的中心。因此人类健康与线粒体的稳态及其正常功能的维持密不可分。本论文的研究围绕线粒体,构建了线粒体与内质网接触位点的报告子,还研究了线粒体内一个参与脯氨酸和鸟氨酸前体吡咯啉-5-羧酸（P5C）合成的酶P5CS调控线粒体内多种代谢途径的分子机制。线粒体与内质网接触位点（MERCs）是线粒体与内质网之间进行钙离子及磷脂交换的位置,也是细胞多种信号通路交互的平台。但目前对MERCs的组成、分布和动态变化了解还十分有限。研究最大的困难是缺乏简单实用的指示MERCs的标记物。本论文第一部分的研究构建了一个全新的能指示MERCs的工具,并利用这个工具分析了在不同刺激下细胞内MERCs的动态变化。这一工具基于Split GFP的Split GFP1-10和Split GFP11距离接近时会相互作用折叠成可以发出绿色荧光的GFP的机理。我们将编码Split GFP1-10和Split GFP11的DNA序列分别与编码内质网和线粒体定位信号的DNA序列连接起来,并在Split GFP11与线粒体定位序列间加入不同长度的连接子,构建表达质粒。进而在细胞中同时... 

【文章页数】：128 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
致谢
摘要
Abstract
缩略词表
1 绪论
    1.1 线粒体与人类健康
    1.2 线粒体-内质网接触
    1.3 脂代谢与疾病
    1.4 总结
2 线粒体-内质网接触位点新型标记工具的构建及其特性研究
    2.1 前言
    2.2 实验材料与方法
        2.2.1 表达质粒构建
        2.2.2 哺乳动物细胞培养及转染
        2.2.3 报告子稳转细胞系的构建
        2.2.4 筛选报告子稳转细胞系
        2.2.5 细胞RNA提取及逆转录
        2.2.6 荧光实时定量PCR
        2.2.7 免疫荧光制片
        2.2.8 细胞荧光成像的观察与处理
        2.2.9 细胞电镜
        2.2.10 细胞周期同步化处理
        2.2.11 药物处理
        2.2.12 Western blot(WB)
        2.2.13 统计分析
        2.2.14 抗体信息
    2.3 实验结果
        2.3.1 构建能监测线粒体和内质网接触位点的报告子
        2.3.2 报告子正确性的验证
        2.3.3 报告子灵敏度的检验
        2.3.4 内质网线粒体接触位点的动态性
        2.3.5 有丝分裂进程中接触位点的观察
        2.3.6 MERCs与线粒体状态高度相关
        2.3.7 MERCs丰度受内质网影响不大
        2.3.8 不同胞内应激条件对MERCs的影响
    2.4 总结与讨论
3 吡咯啉-5-羧酸合成酶可感知细胞应激并通过调节线粒体呼吸来调节其他代谢途径
    3.1 前言
    3.2 实验材料与方法
        3.2.1 表达质粒的构建和siRNA序列信息
        3.2.2 哺乳动物细胞培养及转染
        3.2.3 Cas9 方法制备P5CS敲除细胞系
        3.2.4 果蝇的管理及品系获得
        3.2.5 荧光实时定量PCR
        3.2.6 细胞免疫荧光制片与观察
        3.2.7 细胞内脂消耗速率与合成速率的测量
        3.2.8 电镜样品的制备与观察
        3.2.9 细胞增殖和存活实验
        3.2.10 线粒体蛋白酶K(PK)消化实验
        3.2.11 碱碳酸盐萃取试验
        3.2.12 免疫共沉淀实验(Co-IP)
        3.2.13 细胞线粒体压力测试
        3.2.14 线粒体底物分析
        3.2.15 BN-PAGE分析线粒体复合物
        3.2.16 代谢组学试验
        3.2.17 图像处理及统计分析
    3.3 实验结果
        3.3.1 P5CS在线粒体内呈棒状或环状分布
        3.3.2 P5CS点状分布需要其多聚化位点
        3.3.3 P5CS在氧化应激下定位趋向扩散
        3.3.4 P5CS缺失会导致细胞对胁迫敏感性增加及果蝇的神经退行
        3.3.5 P5CS缺失导致多种代谢缺陷
        3.3.6 P5CS的缺失抑制β-氧化代谢
        3.3.7 P5CS对线粒体正常氧化呼吸的进行至关重要
    3.4 总结讨论
参考文献
线粒体疾病
    综述参考文献
作者简历



本文编号：3663490