一种全新特异性水解线性泛素链的去泛素化酶效应蛋白的发现与机制研究

发布时间：2022-07-29 14:35

　　线性泛素链是真核细胞内一种特殊多聚泛素链,由LUBAC复合物发挥泛素连接酶活性,催化泛素蛋白通过肽键首尾连接而成。线性泛素链参与调节多个细胞生理过程,包括NF-κB信号通路、细胞自噬等。病原菌在长期与宿主斗争中,进化出多种逃逸宿主免疫系统的机制。先前已有研究报道,多种病原菌能够分泌具有去泛素化酶活性的效应蛋白,但这些效应蛋白都只能水解以异肽键连接的泛素链,因此,病原菌中是否存在具有特异性水解线性泛素链活性的效应蛋白,成为了 一个长期存在的科学疑问。为了解决这个问题,我们针对病原菌效应蛋白建立了去泛素化酶的筛选体系。通过筛选我们发现,嗜肺军团菌中的效应蛋白RavD,能够特异性水解线性泛素链。为了揭示RavD的酶活机制,我们通过结构生物学研究,解析了 RavD同源蛋白RavD1c与线性连接的diUb复合物的晶体结构。从结构中我们发现,RavD是一个木瓜蛋白酶样的去泛素化酶,具有Cys-His-Ser催化三联体基序,其三维结构不同于其他去泛素化酶,是一个拥有全新结构的去泛素化酶。RavD结合diUb的两个结合面以及介导和diUb之间相互作用的关键性氨基酸残基决定了 RavD去泛素化酶活性的特... 

【文章页数】：131 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
致谢
摘要
Abstract
1 引言
    1.1 真核细胞泛素化修饰
        1.1.1 泛素化修饰概述
        1.1.2 泛素化修饰过程
        1.1.3 多聚泛素链的功能
        1.1.4 去泛素化酶
        1.1.5 线性泛素链的研究现状
    1.2 嗜肺军团菌
        1.2.1 嗜肺军团菌概况
        1.2.2 嗜肺军团菌的感染过程
        1.2.3 嗜肺军团菌表面毒力因子
        1.2.4 嗜肺军团菌的分泌系统
    1.3 病原菌干扰宿主泛素化修饰
        1.3.1 干扰细胞泛素系统组分
        1.3.2 分泌具有E3连接酶活性的效应蛋白
            1.3.2.1 介导经典泛素化修饰
            1.3.2.2 介导非经典泛素化修饰
        1.3.3 分泌具有DUB活性的效应蛋白
        1.3.4 其他影响
            1.3.4.1 利用泛素系统调控效应蛋白活性
            1.3.4.2 利用泛素化修饰降解其他效应蛋白
    1.4 本研究的研究意义
2 材料与方法
    2.1 材料
    2.2 实验方法
        2.2.1 分子克隆
            2.2.1.1 聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因
            2.2.1.2 PCR产物回收
            2.2.1.3 目的基因定点突变
            2.2.1.4 酶切
            2.2.1.5 连接或重组
            2.2.1.6 转化
            2.2.1.7 目的基因阳性单克隆鉴定
            2.2.1.8 质粒抽提
        2.2.2 蛋白表达与纯化
            2.2.2.1 大肠杆菌表达蛋白
            2.2.2.2 亲和层析纯化标签蛋白
            2.2.2.3 纯化无标签蛋白
            2.2.2.4 离子交换柱纯化
            2.2.2.5 分子筛纯化
        2.2.3 免疫印迹
        2.2.4 细胞转染
        2.2.5 真核细胞蛋白表达检测
        2.2.6 免疫荧光实验
        2.2.7 培养嗜肺军团菌
        2.2.8 构建基因敲除和基因回补的嗜肺军团菌菌株
        2.2.9 制备与转化嗜肺军团菌电转感受态
        2.2.10 合成泛素链
        2.2.11 病原菌筛选实验
        2.2.12 筛选嗜肺军团菌的效应蛋白
        2.2.13 RavD重组蛋白去泛素化酶活性验证
        2.2.14 酶解反应后产生的单泛素蛋白再合链实验
        2.2.15 RavD重组蛋白水解M1-diUb实验
        2.2.16 RavD与GST-Ub,Flag-Ub和Ub-Flag的酶切实验
        2.2.17 GST-diUb pull-down实验
        2.2.18 GST-NEMO UBAN pull-down实验
        2.2.19 RavD抑制细胞内IκBα降解实验
        2.2.20 核内p65转运实验
        2.2.21 磷脂结合实验
        2.2.22 构建OTULIN敲除的U937细胞系
        2.2.23 检测LCV周围的线性链
        2.2.24 检测感染过程中RavD对NF-κB信号通路的影响
        2.2.25 检测RavD对细胞内嗜肺军团菌增殖的影响
        2.2.26 RavD定位实验
        2.2.27 蛋白结晶和结构分析
3 结果与分析
    3.1 嗜肺军团菌具有水解线性泛素链活性
    3.2 嗜肺军团菌效应蛋白RavD发挥水解线性泛素链的活性
    3.3 RavD是一个特异性水解线性泛素链的DUB
        3.3.1 RavD对底物具有特异性
        3.3.2 RavD是一个去泛素化酶
    3.4 RavD和M1-diUb直接相互作用
    3.5 RavD与M1-diUb复合物的三维结构
        3.5.1 RavD的三维结构
        3.5.2 RavD具有Cys-His-Ser催化三联体基序
        3.5.3 RavD特异性的决定因素
    3.6 RavD抑制细胞内NF-κB信号通路
    3.7 RavD在嗜肺军团菌感染过程中的影响
        3.7.1 RavD分泌后定位在LCV膜上
        3.7.2 RavD抑制线性泛素链在LCV上积累
        3.7.3 RavD抑制感染过程中NF-κB信号通路激活
        3.7.4 RavD对嗜肺军团菌在细胞内增殖几乎没有影响
    3.8 RavD广泛存在于军团菌不同菌种中
4 讨论
    4.1 结论
    4.2 讨论与展望
参考文献
作者简历



本文编号：3666639