大鼠CRISP2与PDIA3的相互作用及其在睾丸和精子中的定位研究

发布时间：2017-05-16 12:15

  本文关键词：大鼠CRISP2与PDIA3的相互作用及其在睾丸和精子中的定位研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：哺乳动物精卵融合属于细胞膜融合的一种,它包括很多复杂的步骤,是精卵细胞上多种蛋白因子相互识别、相互作用并且逐渐发生反应的过程。迄今文献报道在卵子和精子上分别鉴定出若干种与精卵融合相关的蛋白因子,卵子上有JUNO、CD9、CD81和GPI-Aps等,精子上有PDIA3、CRISP2、CRISP1、 SLLP1、Equatorin及Izumo1等,但在精卵融合过程中,这些蛋白质分子究竟以何种方式参与了此过程,目前仍然不完全清楚。本实验选取了大鼠的CRISP2和PDIA3为研究对象,研究精子表面的蛋白之间的相互作用,为解析哺乳动物精卵融合的分子机制提供线索。我们在Ensemb1数据库(http://www.ensembl.org/index.html)查询分析大鼠Crisp2 (ENSRNOG00000013225)和Pdia3 (ENSRNOG00000015018)的cDNA序列,设计实验所需引物；用RT-PCR方法克隆大鼠Crisp2和Pdia3的cDNA序列,构建pET32a-Crisp2和pGEX4T-1-Pdia3原核表达载体,制备小鼠抗大鼠CRISP2和PDIA3的多克隆抗体,用免疫组织化学和免疫细胞化学技术研究CRISP2和PDIA3蛋白在大鼠睾丸和精子顶体反应前后的表达定位。实验结果表明大鼠CRISP2和PDIA3蛋白大量出现于其睾丸曲精细管内侧至中央区,即大鼠精子发生和成熟精子出现的区域。免疫细胞化学结果显示：在顶体反应前的大鼠精子细胞中,CRISP2蛋白位于整个大鼠精子上,而大鼠PDIA3蛋白主要存在于精子头、体部,在尾部只有少量分布；顶体反应后大鼠CRISP2存在于精子体、尾部；而大鼠PDIA3发生顶体反应后从精子上消失了。实验克隆到的大鼠Crisp2和Pdia3 cDNA长度分别为730 bp、497 bp,编码243个氨基酸(amino acid简写为：aa,以下类同)和499个氨基酸,N端分别有22 aa和24 aa个氨基酸的信号肽。将克隆得到的大鼠Crisp2和Pdia3 cDNA的成熟肽亚克隆,并按照其多肽结构域分为A、B两段,分别与酵母双杂交载体pGAD和pGBKT相连,构建了分段pGAD-Crisp2A、pGAD-Crisp2B、 pGBKT-Pdia3A、pGBKT-Pdia3B及成熟肽全长pGAD-Crisp2、pGBKT-Pdia3酵母双杂交载体,分组进行酵母双杂交,分析各段多肽之间的相互作用。同时也与真核载体pcDNA3.1相连,构建了分段pcDNA-Crisp2A、pcDNA-Crisp2B、 pcDNA-Pdia3A、pcDNA-Pdia3B及成熟肽全长pcDNA-Crisp2、pcDNA-Pdia3表达载体。把上述的载体成对组合,共转染293T细胞,待表达目的蛋白后,进行免疫共沉淀和Western blot分析CRISP2和PDIA3多肽片段之间的相互作用。实验结果显示大鼠PDIA3-CRISP2成熟肽存在相互作用,各分段中CRISP2A-PDIA3A、CRISP2A-PDIA3B之间亦存在相互作用；CRISP2B-PDIA3A、CRISP2B-PDIA3B之间不存在相互作用。
【关键词】：大鼠 CRISP2 PDIA3 免疫共沉淀 酵母双杂交
【学位授予单位】：内蒙古大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q78
【目录】：

• 符号说明4-5
• 摘要5-7
• ABSTRACT7-13
• 第一部分 文献综述 膜融合机制的研究进展13-27
• 1 历史回顾13-14
• 2 病毒的膜融合机制14-16
• 2.1 Ⅰ型病毒的膜融合相关机制14-16
• 2.2 Ⅱ型病毒的膜融合相关机制16
• 3 体细胞膜融合机制16-18
• 4 动物生殖细胞膜融合相关机制18-25
• 4.1 卵子表面的精卵融合相关蛋白19-21
• 4.2 精子上的精卵融合相关蛋白因子21-24
• 4.3 精卵融合有关的酶24
• 4.4 精卵相互作用有关的抗原24-25
• 5 植物配子融合相关机制25-26
• 6 展望26-27
• 第二部分 研究论文27-101
• 第一章 大鼠Crisp2和Pdia3的cDNA的克隆27-44
• 前言27
• 1 材料与方法27-31
• 1.1 主要实验器材27-28
• 1.2 载体与苗种28
• 1.3 实验试剂与方法28-31
• 2 结果31-41
• 2.1 大鼠附睾、睾丸组织总RNA的提取31-32
• 2.2 大鼠Crisp2和Pdia3的PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定32-33
• 2.3 pMD19-T重组载体的双酶切鉴定33-34
• 2.4 大鼠PDIA3和CRISP2 cDNA结构分析34
• 2.5 大鼠PDIA3和CRISP2氨基酸序列的分析34-36
• 2.6 大鼠PDIA3和CRISP2的二级结构和性质以及三维结构预测36-41
• 3 讨论41-44
• 第二章 大鼠CRISP2和PDIA3融合蛋白的原核表达及纯化44-57
• 前言44
• 1 材料和方法44-50
• 1.1 材料44-46
• 1.2 实验方法46-50
• 2 结果50-56
• 2.1 Pdia3和Crisp2全长测序结果分析(见第一章结构分析)50-51
• 2.2 大鼠Pdia3和Crisp2 PCR产物、重组克隆T载体的构建及pET32a-Crisp2、pGEX4T-1-Pdia3重组载体酶切鉴定51-52
• 2.3 pET32a-CRISP2、pGEX4T-1-PDIA3在大肠杆菌中的诱导表达与His-CRISP2、GST-PDIA3融合蛋白的Western-blot鉴定52-55
• 2.4 纯化后的His-CRISP2和GST-PDIA3融合蛋白浓度的测定55-56
• 3 讨论56-57
• 第三章 小鼠抗大鼠CRISP2和PDIA3腹水多克隆抗体的制备及纯化57-66
• 前言57-58
• 1 材料和方法58-61
• 1.1 材料58
• 1.2 实验方法58-61
• 2 结果61-64
• 2.1 小鼠抗GST-PDIA3和His-CRISP2多克隆抗体的鉴定62
• 2.2 大鼠PDIA3和CRISP2纯化抗体特异性测定62-63
• 2.3 CRISP2、PDIA3抗体的效价测定63-64
• 3 讨论64-66
• 第四章 大鼠PDIA3和CRISP2蛋白在其睾丸组织和精子中的定位66-74
• 前言66
• 1 材料和方法66-69
• 1.1 材料66-68
• 1.2 实验方法68-69
• 2 结果69-72
• 2.1 大鼠睾丸组织中PDIA3和CRISP2的定位69-71
• 2.2 大鼠PDIA3和CRISP2在精子细胞顶体反应前后不同形态的免疫化学定位71-72
• 3 讨论72-74
• 第五章 大鼠PDIA3、CRISP2酵母双杂交作用的研究74-87
• 前言74
• 1 材料与方法74-79
• 1.1 试剂74-76
• 1.2 实验方法76-79
• 2 结果79-85
• 2.1 大鼠Pdia3和Crisp2的PCR凝胶电泳79-80
• 2.2 pGADT7和pGBKT7酶切鉴定80-81
• 2.3 Y2H和Y187双杂交目的阳性菌凝胶电泳鉴定81-82
• 2.4 酵母菌Y187和Y2H Gold交配82-83
• 2.5 SD/-Leu or如/-Trp的菌落生长结果83
• 2.6 SD/-Leu/-Trp的菌落生长结果83-84
• 2.7 SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-a -Ga/Aba (QXA)的菌落生长结果84-85
• 3 讨论85-87
• 第六章 大鼠PDIA3和CRISP2蛋白相互作用的研究87-101
• 前言87-88
• 1 材料与方法88-92
• 1.1 实验器材88
• 1.2 实验方法88-92
• 1.2.1 试剂88
• 1.2.2 引物的设计与合成88-89
• 1.2.3 pcDNA表达载体的构建89-90
• 1.2.4 293T细胞的培养90
• 1.2.5 细胞共转染90-91
• 1.2.6 细胞转染后目的蛋白收集91
• 1.2.7 免疫共沉淀91
• 1.2.8 目的蛋白的Western blot检n,91-92
• 2 结果92-99
• 2.1 PCR产物凝胶电泳分析鉴定92
• 2.2 pcDNA3.1表达载体的构建及双酶切分析92-94
• 2.3 目的蛋白Western blot结果94-99
• 3 讨论99-101
• 结论101-102
• 参考文献102-107
• 致谢107-108
• 攻读博士学位期间参与的科研项目和发表的学术论文10

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