衣壳蛋白VP0关键氨基酸位点对EV71病毒组装和侵入的影响及其机制研究

发布时间：2022-12-07 17:32

　　肠道病毒71型（Enterovirus71,EV71）属于小RNA病毒科,是引起婴幼儿手足口病的主要病原体,会导致严重的神经系统疾病,如无菌性脑膜炎,脑炎,脊髓灰质炎样麻痹,严重者可导致死亡。小RNA病毒衣壳蛋白对于病毒包装、侵入来说至关重要,然而在EV71病毒中,衣壳蛋白上,特定氨基酸位点对病毒功能方面的影响还知之甚少。基于对其他小RNA病毒衣壳蛋白的研究可知,VP0豆蔻酰化位点影响病毒的入侵和脱衣壳过程;VP0裂解位点影响病毒衣壳的组装和成熟。然而对于EV71病毒来说,这两类氨基酸位点的位置与功能未见报道,所以弄清其作用机制对EV7病毒的预防与抗病毒药物发现至关重要。所以本论文对这两类位点进行了研究,分别分为对豆蔻酸结合位点的研究和衣壳蛋白VP0裂解位点的研究两部分。第一部分:豆蔻酸结合位点对EV71病毒侵入的影响豆蔻酰化是蛋白N末端与豆蔻酸共价连接的过程,一些文献报道,小RNA病毒的豆蔻酰化影响病毒组装和感染力,是影响病毒生命周期的一个重要氨基酸位点。在EV71病毒中,发生豆蔻酰化的位点是VP4 N末端的第二位甘氨酸。首先,我们构建了带有报告基因的EV71豆蔻酰化缺失型假病毒（L... 

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【学位级别】：博士

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中文摘要
Abstract
缩略词表
第一章 引言
    1.1 手足口病
    1.2 手足口病病原体
    1.3 EV71 的生命周期
        1.3.1 病毒与宿主的结合
        1.3.2 病毒的翻译
        1.3.3 病毒的复制
        1.3.4 病毒的组装
        1.3.5 病毒的释放
    1.4 影响病毒生命周期的衣壳蛋白重要氨基酸位点
    1.5 豆蔻酸结合位点
        1.5.1 豆蔻酰化
        1.5.2 豆蔻酸结合位点
        1.5.3 豆蔻酰化蛋白及重要作用
    1.6 EV71 VP0 的裂解位点
        1.6.1 小RNA病毒VP0 的裂解
        1.6.2 小RNA病毒的VP0 裂解位点
        1.6.3 VP0 裂解对病毒结构的影响
        1.6.4 VP0 的裂解对病毒组装的影响
    1.7 立题依据
    1.8 创新点
第二章 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 细胞和菌株
        2.1.2 抗体
        2.1.3 实验室保存质粒列表
        2.1.4 常用试剂
        2.1.5 引物设计
    2.2 仪器与设备
    2.3 实验方法
        2.3.1 质粒的构建
        2.3.2 多肽合成
        2.3.3 细胞培养
        2.3.4 病毒制备与包装
        2.3.5 病毒蛋白电泳与免疫印迹(western-blot)
        2.3.6 透射电镜(TEM)
        2.3.7 高压冷冻电镜
        2.3.8 荧光素报告基因的检测
        2.3.9 细胞病变效应检测(CPE assay)
        2.3.10 病毒核酸提取与定量反转录-聚合酶链式反应(qRT-PCR)
        2.3.11 病毒负链核酸提取与定量反转录-聚合酶链式反应
        2.3.12 免疫荧光测定
        2.3.13 细胞质与细胞膜结构分离实验
        2.3.14 脂质体渗漏试验
        2.3.15 VP0和VP2 蛋白的质谱分析
        2.3.16 统计分析
第三章 豆蔻酰化位点对EV71 生命周期的影响
    3.1 豆蔻酰化的缺失不影响病毒的组装
    3.2 豆蔻酰化缺失造成病毒感染性降低
    3.3 豆蔻酰化的缺失阻断了病毒基因组RNA在感染细胞中的复制
    3.4 豆蔻酰基团影响病毒感染的早期阶段
    3.5 豆蔻酰基团与宿主细胞膜结构相互作用
    3.6 豆蔻酰基团介导膜结构的通透性
    3.7 讨论
    3.8 本章小结
第四章 VP0 裂解位点对EV71 病毒组装的影响
    4.1 EV71 VP0 裂解位点的确定
    4.2 VP0 裂解位点对EV71 病毒感染性和组装的影响
        4.2.1 VP0 裂解位点对EV71 病毒感染性的影响
        4.2.2 VP0 裂解位点对EV71 病毒组装的影响
    4.3 EV71 VP0 裂解机制的研究
    4.4 讨论
    4.5 本章小结
结论
参考文献
作者简介及攻读博士期间发表的文章
致谢



本文编号：3712547