CRISPR/Cas9基因敲除技术在家蚕基因功能研究中的应用

发布时间：2023-02-06 17:42

　　家蚕是重要的吐丝营茧昆虫,也是生物研究的模式昆虫之一。CRISPR/Cas9基因敲除系统是近两年发展起来的一种来源于细菌获得性免疫系统的基因编辑技术,经过人工的改造,目前已被广泛运用于多种模式生物的研究,成为一种强大的研究工具。本研究分别选择了家蚕体壁等颜色相关和丝腺发育相关的两类基因,利用CRISPR/Cas9系统敲除基因后获得突变体,成功建立了一套高效快速的家蚕基因敲除技术体系,为家蚕功能基因组学的研究提供了一个有力的工具。同时,对敲除了丝腺相关基因的家蚕个体进行了转录组测序RNA-seq,初步阐释了家蚕丝腺发育的分子机制。主要结果如下：1.运用CRISPR/Cas9系统成功敲除了家蚕4个与体壁等透明性及颜色相关的基因Bm-ok、BmKMO、BmTH、Bmtan。根据靶点设计原则,对这4个基因共设计了8个靶点,其中BmTH3个,Bm-ok, Bmtan各2个,BmKMO仅1个靶点。将体外合成的高质量的Cas9-mRNA和sgRNA混合后显微注射到家蚕刚产的卵内,结果表明这8个靶点的sgRNA均发挥了敲除效应,敲除的突变率大概为16.7%-35.0%,但不同基因不同靶点的突变率不同,...

【文章页数】：111 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
中文摘要
Abstract
主要英文缩写与译名
第一章 文献综述
    1. 引言
    2. CRISPR/Cas系统介绍
        2.1 CRISPR/Cas系统的来源
        2.2 CRISPR/Cas系统的组成和结构特点
            2.2.1 CRISPR结构
            2.2.2 Cas基因
            2.2.3 CRISPR/Cas系统的分类
        2.3 CRISPR/Cas系统的工作机理
    3. CRISPR/Cas9系统的应用
        3.1 CRISPR/Cas9研究现状
        3.2 CRISPR/Cas9在基因编辑中的应用
        3.3 CRISPR/Cas9敲除基因的机制
        3.4 CRISPR/Cas9脱靶效应
        3.5 CRISPR/Cas9其他方面的应用
    4. 家蚕丝腺介绍
        4.1 家蚕丝腺的形态特点与功能
        4.2 家蚕丝腺的组织结构
        4.3 家蚕丝腺的发育概况
            4.3.1 家蚕丝腺发育的基本过程
            4.3.2 家蚕丝腺发育的分子机理
    5. 家蚕Bmsage基因研究概况
    6. 反向遗传学技术
    7. 第二代高通量测序技术
    8. 研究目的及意义
    9. 主要内容
        9.1 利用CRISPR/Cas9研究家蚕体壁等相关基因的功能
        9.2 利用CRISPR/Cas9研究家蚕丝腺相关基因的功能
    10. 技术路线
第二章 利用CRISPR/Cas9研究家蚕体壁相关基因的功能
    1. 引言
    2. 实验材料与方法
        2.1 实验材料
            2.1.1 家蚕
            2.1.2 主要实验仪器
            2.1.3 主要试剂和试剂盒
            2.1.4 主要试剂的配制
            2.1.5 DNA测序
        2.2 实验方法
            2.2.1 蚕卵滞育性的解除
            2.2.2 CRISPR/Cas9靶点设计
            2.2.3 所选基因靶点序列的确认
            2.2.4 Cas9-mRNA的体外合成
            2.2.5 sgRNA的体外合成
            2.2.6 家蚕卵的显微注射
            2.2.7 突变率和突变类型的检测
            2.2.8 脱靶效应的检测
            2.2.9 突变体表型筛选
            2.2.10 蛾子交配策略
    3. 实验结果
        3.1 Bm-ok敲除结果
        3.2 BmKMO、BmTH和Bmtan敲除结果
        3.3 脱靶效应的检测
    4. 讨论
第三章 利用CRISPR/Cas9研究家蚕丝腺发育相关基因的功能
    1. 引言
    2. 实验材料与方法
        2.1 实验材料
            2.1.1 家蚕
            2.1.2 主要实验仪器
            2.1.3 主要试剂和试剂盒
            2.1.4 DNA测序
        2.2 实验方法
            2.2.1 Bmsage注射死胚的检测
            2.2.2 Bmsage G₀代蛾子的检测
            2.2.3 Bmsage突变体筛选和表型分析
            2.2.4 Bmsage突变体表型的确认
    3. 实验结果
        3.1 Bmsage靶点设计及确认
        3.2 Bmsage突变率
        3.3 Bmsage突变体表型的分析和筛选
            3.3.1 Bmsage G₀代蛾子的交配
            3.3.2 Bmsage G₁代突变体筛选
            3.3.3 Bmsage G₂代纯合突变体筛选
            3.3.4 Bmsage突变体表型分析
            3.3.5 Bmsage突变体胚胎期丝腺形态
            3.3.6 不同基因型的Bmsage突变体筛选
        3.4 Bmsage突变体化蛹期的生长情况
        3.5 Bmsage突变体蛾子生长情况
        3.6 Bmsage敲除的脱靶效应
    4. 讨论
第四章 家蚕Bmsage丝腺缺失突变体的RNA-seq分析
    1. 引言
    2. 实验材料与方法
        2.1 实验材料
            2.1.1 家蚕
            2.1.2 主要实验仪器
            2.1.3 主要试剂
        2.2 实验方法
            2.2.1 样品制备和上机测序
            2.2.2 测序数据生物信息学分析
            2.2.3 qRT-PCR验证基因表达水平
    3. 实验结果
        3.1 RNA-seq数据预处理
        3.2 qRT-PCR验证结果
        3.3 差异基因分析与筛选
        3.4 差异基因的GO、KEGG信号通路分析
            3.4.1 差异基因的GO分析
            3.4.2 差异基因的KEGG信号通路分析
            3.4.3 差异基因的WEGO分析
    4. 讨论
第五章 结论及后续研究展望
    1. 主要结论
    2. 创新点
    3. 后续研究展望
参考文献
附录
    1. 攻读博士学位期间发表论文
    2. 参与课题
致谢



本文编号：3736337