吡喃糖氧化酶和漆酶在木质素生物降解中作用的研究

发布时间：2017-05-17 22:12

  本文关键词：吡喃糖氧化酶和漆酶在木质素生物降解中作用的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：木质素是由苯丙烷结构单元通过碳碳键和醚键连接而成的天然高分子聚合物。它是自然界中含量仅次于纤维素的第二大可再生有机资源。木质素非常难以降解,在植物细胞壁中,它与半纤维素一起包裹着纤维素,对植物起保护作用。木质素的降解是自然界碳素循环的限速步骤。然而,对于生物质资源的利用,木质素的存在是一个障碍。木质素的生物降解是实现生物质资源有效利用的一条重要途径。白腐真菌是自然界中唯一能够彻底将木质素分解为CO2和H2O的生物。木质素过氧化物酶(LiP)、锰过氧化物酶(MnP)和漆酶是白腐真菌产生的说要木质素降解酶。然而,这些酶在胞外很难实现对天然木质素的彻底降解,反而更倾向于导致木质素的聚合。这说明白腐真菌在体内必定有一套人们尚未发现的调节木质素聚合和降解的机制。吡喃糖2-氧化酶(P2O)在白腐真菌中广泛存在。它可以氧化多种吡喃糖C-2位产生相应的酮糖,同时将O2还原为H2O2。P2O在白腐真菌中的作用被认为是为过氧化物酶提供H2O2。有研究表明,对于P2O,一些醌类和自由基是比O2更好的电子受体。鉴于此,P2O可能通过还原木素降解过程中产生的自由基和醌类中间体来抑制它们的聚合,与木质素降解酶协同作用,促进木质素的降解。但这个推测尚未得到实验证实。因此,本研究的目的之一就是探讨P2O和漆酶在木质素降解中的协同作用。漆酶能对多种底物进行单电子氧化,这使其在制浆造纸、废水处理、有机合成等多个工业领域有诱人的应用前景。最近,漆酶在木质素改性,促进木质素的高值化利用方面也引起了人们的关注。寻找适合工业应用的漆酶是当前的研究热点。本实验室保存了大量的白腐真菌菌种资源,其中Trametes trogii YDHSD是一株非常高效的漆酶产生菌。本论文对T. trogii漆酶进行了分离纯化和酶学性质研究,并探讨了它在碱木素改性和染料脱色中的应用。本论文的主要研究内容和结果如下：1.吡喃糖-2-氧化酶(P2O)的分离纯化和表征使用硫酸铵分级沉淀、疏水层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析等方法从白腐真菌Irpex lacteus dft-1中分离纯化得到一种氧化葡萄糖并产H2O2的酶,纯化倍数27.9,得率27.4%。经TLC和GC-MS分析,该酶氧化葡萄糖的产物为2-酮-D-葡萄糖,从而确定该酶为P20,而非葡萄糖-1-氧化酶。凝胶过滤显示该酶分子量为266 kDa, SDS-PAGE显示亚基分子量为71 kDa,表明该酶有4个亚基。该酶表现出典型黄素蛋白的紫外可见光谱特征。该酶的最适pH为6.5,最适温度为55℃,在较宽的pH范围(5-11)和温度范围内(低于60℃)都非常稳定。D-葡萄糖、D-半乳糖、L-山梨糖、D-木糖和D-葡萄糖酸-1,5-内酯等多种单糖都可被该酶氧化,少数双糖,比如麦芽糖和纤维二糖也能被I. lacteus P20氧化。对这些糖类底物的动力学参数Km和Kcat的测定表明,D-葡萄糖是该酶的最适底物。P2O不仅对其电子供体具有非特异性,对电子受体也表现出非特异性。除了O2,对苯醌、甲基对苯醌、2,6-二甲基对苯醌、DCIP等醌类物质和ABTS阳离子自由基也可以作为P2O的电子受体。根据动力学参数判断,某些醌类甚至比O2更容易被P20还原。自由基和醌类是木质素降解的重要中间产物。P20还原醌类底物的特性可能在木质素的生物降解中起重要作用。2.P2O和漆酶在木质素降解中的协同作用研究使用分光光度法发现漆酶可以氧化2,6-DMP、愈创木酚、儿茶酚等酚类化合物和木素磺酸盐,产生醌类结构,导致特定波长下的吸光度增加。P2O的加入可以还原反应生成的这些醌类物质。为了研究P2O和漆酶在木质素生物降解中的协同作用,对四种工业木质素,即木素磺酸盐、碱木素、蔗渣CEL、桉木CEL,分别进行漆酶单独处理和漆酶与P20共同处理。使用GPC分析了酶作用后的木质素的分子量分布。结果表明,在漆酶的作用下,木质素发生了聚合,分子量增大。然而,P2O的加入有效地抑制了聚合,甚至引起木素磺酸盐的降解。另外,红外光谱分析表明单独漆酶处理对木质素的结构影响不大。而当P2O与漆酶协同处理时,木质素中的共轭羰基含量显著增加,这很有可能是木质素结构单元中Cα氧化的结果。这表明,P2O的加入促进了漆酶对木质素的氧化。以上结果说明,P2O能够还原木质素氧化过程中产生的自由基和醒类中间体,从而抑制漆酶催化的木质素的聚合,并能在一定程度上促进木质素的氧化降解。除了为LiP和MnP提供H2O2,抑制木质素降解碎片的再聚合可能是P2O的另外一个生理功能。鉴于P2O在白腐真菌中的广泛分布,P2O与漆酶或过氧化物酶协作维持一种氧化还原循环,可能是白腐真菌用来调控木质素聚合和降解的一种通用机制。3.漆酶的分离纯化和表征利用硫酸铵分级沉淀、阴离子交换层析、凝胶过滤层析等手段,从白腐真菌T. trogii YDHSD中分离纯化得到一种蓝漆酶。该酶是一个单体蛋白,根据SDS-PAGE测定的分子量为64 kDa。该酶对不同底物的最适pH在2.2到4.5范围内,最适温度为70℃。该漆酶表现出较高的热稳定性,60℃半衰期为1.6小时。该漆酶底物范围非常广泛,一系列酚类化合物都能被其氧化。另外,该漆酶能在不加介体的情况下直接氧化非酚型偶氮染料甲基红。根据其动力学参数判断,ABTS是该漆酶的最适底物。与其它漆酶相比,该漆酶对ABTS和丁香醛连氮有非常高的亲和力。而且,该漆酶具有良好的金属离子耐受性。这些优良特性说明T. trogii漆酶具有广泛的工业应用前景。4.漆酶对碱木素的改性GPC分析表明T. trogii该漆酶可以有效地氧化碱木素导致其聚合。碱木素聚合反应的最适pH在6到6.5范围内。在pH6.5的缓冲液中,经漆酶处理后24 h后,碱木素的重均分子量增大了5.4倍。FTIR、元素分析和1H NMR分析表明,漆酶处理导致碱木素的官居能团发生改变。经漆酶氧化聚合,碱木素中的羰基和脂肪族羟基含量增加,甲氧基含量减少。酚羟基含量少量增加。此外,木素氧化过程中缩合结构含量增加。这些结果表明,T. trogii漆酶在木质素改性中具有潜在的的应用价值。5.漆酶在染料脱色中的应用T. trogii漆酶可以在不加介体的情况下直接对多种染料氧化脱色,包括蒽醌类染料茜红素S、RBBR,三苯甲烷类染料溴酚蓝、亮绿,偶氮类染料甲基红、甲基橙、刚果红等。反应的pH、温度、染料初始浓度和漆酶加入量对脱色效率均具有不同程度的影响。在加入介体的情况下,该漆酶可以氧化脱色的染料范围变得更为广泛,十余种不同染料都可被其脱色。不同的介体对染料脱色的促进效果有所不同。
【关键词】：自腐真菌 木质素 吡喃糖氧化酶 漆酶 染料脱色
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：O636.2;Q814
【目录】：

• 摘要12-15
• ABSTRACT15-19
• 符号说明19-21
• 第一章 研究背景21-53
• 1.1 木质素的结构与生物合成21-28
• 1.1.1 木质素的分布与结构21-25
• 1.1.2 木质素的生物合成25-28
• 1.2 木质素的生物降解28-33
• 1.2.1 木质素降解与生物质资源的利用28-29
• 1.2.2 白腐真菌及其木质素降解系统的特点29-30
• 1.2.3 木质素降解相关酶30-32
• 1.2.4 参与木质素降解的活性小分子物质32-33
• 1.3 吡喃糖氧化酶33-38
• 1.3.1 吡喃糖氧化酶的性质33-35
• 1.3.2 吡喃糖氧化酶的生理作用35-37
• 1.3.2.1 为木素降解过氧化物酶提供H20235-36
• 1.3.2.2 参与抗生素蓝草菌酮的合成36
• 1.3.2.3 参与木质素降解中的还原反应36-37
• 1.3.3 吡喃糖氧化酶的应用37-38
• 1.4 漆酶38-51
• 1.4.1 漆酶的研究进程38-39
• 1.4.2 漆酶的分布39-41
• 1.4.2.1 植物漆酶39
• 1.4.2.2 动物漆酶39-40
• 1.4.2.3 真菌漆酶40
• 1.4.2.4 原核生物漆酶40-41
• 1.4.3 漆酶的结构和理化特征41-45
• 1.4.3.1 漆酶的分子量41-42
• 1.4.3.2 漆酶的糖基化42
• 1.4.3.3 漆酶的等电点42
• 1.4.3.4 漆酶的三维结构42-43
• 1.4.3.5 漆酶的活性中心和催化机理43-45
• 1.4.4 漆酶的底物45-46
• 1.4.5 漆酶/介体系统(LMS)46-48
• 1.4.6 漆酶的应用48-51
• 1.4.6.1 造纸工业48-49
• 1.4.6.2 环境保护与修复49-50
• 1.4.6.3 木质纤维材料的改性50
• 1.4.6.4 漆酶在食品工业中的应用50-51
• 1.5 本课题的意义、目的和研究内容51-53
• 第二章 吡喃糖氧化酶的纯化和表征53-73
• 引言53-54
• 2.1 材料与方法54-58
• 2.1.1 试剂54
• 2.1.2 菌株与培养方法54
• 2.1.3 P2O酶活和蛋白质浓度的测定54
• 2.1.4 P2O的分离纯化54-55
• 2.1.5 P2O的酶学性质研究55-58
• 2.1.5.1 SDS-PAGE和Native-PAGE55-56
• 2.1.5.2 分子量测定56
• 2.1.5.3 葡萄糖氧化产物的制备和鉴定56-57
• 2.1.5.4 P2O紫外可见吸收光谱的测定57
• 2.1.5.5 pH对P2O活性和稳定性的影响57
• 2.1.5.6 温度对P2O活性和稳定性的影响57
• 2.1.5.7 P2O底物广泛性及动力学参数测定57-58
• 2.2 结果与讨论58-72
• 2.2.1 P2O的纯化58-60
• 2.2.2 P2O氧化葡萄糖产物的鉴定60-62
• 2.2.3 P2O的分子量测定62-63
• 2.2.4 P2O的紫外可见光谱学特征63
• 2.2.5 pH对P2O活性和稳定性的影响63-65
• 2.2.6 温度对P2O活性和稳定性的影响65-66
• 2.2.7 P2O的底物特异性及动力学特征66-72
• 2.3 本章小结72-73
• 第三章 P2O与漆酶在木质素降解中的协同作用73-85
• 引言73-74
• 3.1 材料与方法74-76
• 3.1.1 实验用酶及木质素的制备74
• 3.1.2 P2O对漆酶催化生成的醌类的作用74-75
• 3.1.3 漆酶和P2O协同处理工业木质素75
• 3.1.4 木质索的GPC分析75
• 3.1.5 木质素的FTIR分析75-76
• 3.2 结果76-81
• 3.2.1 P2O对漆酶催化产生的醌类的还原76-77
• 3.2.2 漆酶和P2O协同处理工业木质素77-79
• 3.2.3 木质素的FTIR分析79-81
• 3.3 讨论81-83
• 3.4 本章小结83-85
• 第四章 漆酶的分离纯化和表征85-99
• 引言85
• 4.1 材料与方法85-88
• 4.1.1 菌株和培养条件85-86
• 4.1.2 漆酶活性和蛋白浓度测定86
• 4.1.3 漆酶的分离纯化86-87
• 4.1.4 漆酶的酶学性质研究87-88
• 4.1.4.1 漆酶的电泳分析87
• 4.1.4.2 漆酶的紫外-可见光谱分析87
• 4.1.4.3 pH对漆酶活性和稳定性的影响87
• 4.1.4.4 温度对漆酶活性和稳定性的影响87-88
• 4.1.4.5 漆酶底物特异性和酶促动力学88
• 4.1.4.6 金属离子和抑制剂对漆酶活性的影响88
• 4.2 结果与讨论88-98
• 4.2.1 漆酶的纯化及其分子特征88-90
• 4.2.2 pH对漆酶活性和稳定性的影响90-91
• 4.2.3 温度对漆酶活性和稳定性的影响91-92
• 4.2.4 漆酶底物特异性及其酶促动力学特征92-95
• 4.2.5 金属离子和抑制剂对漆酶活性的影响95-98
• 4.3 本章小结98-99
• 第五章 漆酶对木质素的改性99-111
• 引言99-100
• 5.1 材料与方法100-101
• 5.1.1 漆酶对碱木素的处理100
• 5.1.2 木质素的GPC分析100-101
• 5.1.3 木质素的红外光谱分析101
• 5.1.4 木质素的元素分析101
• 5.1.5 木质素的~1H NMR分析101
• 5.2 结果与讨论101-109
• 5.2.1 漆酶在不同pH下对碱木素的聚合作用101-104
• 5.2.2 FTIR分析104-107
• 5.2.3 元素分析和~1H NMR107-109
• 5.3 本章小结109-111
• 第六章 漆酶催化染料脱色的研究111-127
• 引言111-112
• 6.1 材料与方法112-114
• 6.1.1 主要试剂和仪器112
• 6.1.2 漆酶酶活的测定方法112
• 6.1.3 染料的紫外可见光谱¨描112-113
• 6.1.4 漆酶对染料的脱色实验113
• 6.1.5 漆酶/介体体系对染料的脱色113-114
• 6.2 结果与讨论114-126
• 6.2.1 染料的紫外可见光谱114-116
• 6.2.2 pH对染料脱色的影响116-117
• 6.2.3 温度对染料脱色的影响117-118
• 6.2.4 染料初始浓度对脱色的影响118-119
• 6.2.5 漆酶量对染料脱色的影响119-120
• 6.2.6 染料脱色过程中的紫外可见光谱120-121
• 6.2.7 漆酶价体体系对染料的脱色121-126
• 6.3 本章小结126-127
• 全文总结与展望127-129
• 参考文献129-153
• 致谢153-154
• 攻读博士学位期间发表文章154-155
• 译文155-173
• 附件173

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