APE1促进DNA-PKcs介导hnRNPA1磷酸化及其在有丝分裂期端粒保护中的作用
本文关键词：APE1促进DNA-PKcs介导hnRNPA1磷酸化及其在有丝分裂期端粒保护中的作用，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：研究背景细胞在有丝分裂的过程中,端粒不仅能够阻止核酸酶对染色体的降解,而且可以通过抑制DNA损伤反应(DNA damage reaction,DDR)防止亲代细胞染色体末端相互融合以及非整倍体子代细胞的产生,从而预防由于基因组不稳定性引起亲代和/或子代细胞衰老、凋亡或癌变等严重后果的发生。端粒功能的维持依赖于端粒相关结合蛋白,其中hn RNPA1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1)的作用尤为重要。为了阻止端粒单链DNA被误识别为损伤的DNA而诱发DDR,hn RNPA1能够开启端粒单链DNA上RPA(replication protein A)向POT1(protection of telomeres 1)转换,进而有效地抑制DDR通路上游的关键激酶ATR(ataxia-telangiectasia and Rad3-related)被RPA激活。近年研究发现hn RNPA1是DNA-PKcs(DNA-dependent protein kinase catalytic subunit)的磷酸化底物,且DNA-PKcs缺失会导致大量端粒融合的现象,因而我们推测DNA-PKcs可能通过调控hn RNPA1活性发挥了端粒保护作用。此外,DNA-PKcs作为DNA依赖性蛋白激酶(DNA-dependent protein kinase,DNA-PK)的催化亚基是DNA双链断裂修复(double strand break repair,DSBR)中关键的限速酶,而大量研究证据表明脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子(Apurinic aprimidinic endonuclease 1,APE1)从基因转录水平或翻译后修饰水平可调控大量DSBR相关蛋白的表达及其活性,进而既保持了染色体的完整性又确保了基因组的稳定性,但是APE1是否调控DNA-PKcs蛋白激酶进而促进其对端粒的保护作用仍不清楚。本研究拟利用人工合成的端粒单链DNA、hn RNPA1纯化蛋白、特异性抑制剂和基因敲除细胞株,通过运用蛋白功能位点突变、GST-pulldown、磁珠pulldown法和染色体定向荧光原位杂交等技术,以期研究双功能蛋白APE1调控DNA-PKcs蛋白激酶的分子机制,并进一步探讨有丝分裂过程中DNA-PKcs磷酸化hn RNPA1的调控机制及其在介导端粒单链DNA上RPA向POT1转换过程中的重要作用,最终阐明“APE1—DNA-PKcs—hn RNPA1”调控通路对有丝分裂期端粒的保护作用,为揭示细胞端粒的保护机制具有重要意义。研究目的1.研究APE1氧化还原功能调控DNA-PKcs激酶活性的分子机制;2.探讨DNA-PKcs在有丝分裂期磷酸化hn RNPA1的调控机制;3.探明磷酸化的hn RNPA1促进端粒单链DNA上RPA向POT1转换的调节作用及其对有丝分裂期端粒的保护作用。研究内容和方法1.APE1氧化还原功能对DNA-PKcs激酶活性的影响:以APE1稳定敲低型和氧化还原缺失型细胞株为主要研究对象,同时通过Western blot、免疫荧光共聚焦显微镜、DNA末端连接活性分析和免疫共沉淀的实验方法观察APE1及其氧化还原功能对DNA-PKcs的蛋白表达、激酶活性及NHEJ修复活性的调控作用,旨在为研究APE1氧化还原功能的生物学新效应提供理论基础。2.DNA-PKcs激酶介导有丝分裂期hn RNPA1磷酸化的机制研究:利用底物磷酸化抗体、特异性激酶抑制剂、功能位点突变的hn RNPA1表达载体以及纯化蛋白等,通过运用细胞周期同步法、Western Blot、免疫共沉淀和GST-pulldown的实验方法揭示DNA-PKcs与hn RNPA1相互结合的结构域,以及细胞内DNA-PKcs结合并磷酸化hn RNPA1的影响因素,旨在为诠释DNA-PKcs与hn RNPA1之间相互作用的分子机制提供实验依据。3.hn RNPA1磷酸化促进其对有丝分裂期端粒的保护作用:以hn RNPA1敲除及其功能突变的细胞系为主要研究对象,同时辅以特异性激酶抑制剂,人工合成的端粒单链DNA和肽核酸端粒荧光原位杂交探针等手段和工具,以期回答磷酸化hn RNPA1对端粒单链DNA上RPA向POT1转换的调控及其在有丝分裂期端粒保护中的作用,旨在系统性地阐明hn RNPA1在端粒相关蛋白网络中的调控轴。研究结果1.APE1氧化还原功能对DNA-PKcs激酶活性的影响:APE1与DNA-PKcs可形成蛋白复合物,并且APE1氧化还原功能功能并不调控DNA-PKcs的转录表达,而是影响DNA-PKcs激酶活性及其NHEJ修复活性。2.DNA-PKcs激酶介导有丝分裂期hn RNPA1磷酸化的机制研究:在G2/M期的细胞中,hn RNPA1与DNA-PKcs之间的亲和力以及hn RNPA1磷酸化水平均最高,且DNA-PKcs磷酸化hn RNPA1的位点是第95位和192位丝氨酸;通过结构域图谱测绘分析发现hn RNPA1主要结合DNA-PKcs的PIKK调控结构域,而DNA-PKcs主要与hn RNPA1的RRMs结构域相互结合;进一步发现磷酸化模拟突变型hn RNPA1结合端粒单链DNA的亲和力明显高于DNA-PKcs,导致端粒单链DNA对DNA-PKcs与hn RNPA1相互结合具有拮抗作用。3.hn RNPA1磷酸化促进其对有丝分裂期端粒的保护作用:磷酸化模拟突变型hn RNPA1结合端粒单链DNA的亲和力以及促进端粒单链DNA上RPA向POT1转换的能力均明显高于去磷酸化突变型hn RNPA1;DNA-PKcs及其激酶活性可调控hn RNPA1结合端粒单链DNA的亲和力以及hn RNPA1取代端粒单链DNA上RPA的能力,并且DNA-PKcs敲除细胞内过表达酸磷酸化模拟突变型hn RNPA1蛋白会逆转DNA-PKcs敲除导致hn RNPA1取代RPA能力下降的效应;通过端粒荧光原位杂交技术发现有丝分裂期hn RNPA1敲除后导致端粒区DDR,而hn RNPA1磷酸化会削弱有丝分裂期细胞内DDR;进一步发现hn RNPA1敲除细胞或表达去磷酸化突变型hn RNPA1的细胞中有丝分裂期出现异常端粒的百分比均高于野生型细胞或表达磷酸化模拟突变型hn RNPA1的细胞。结论1.双功能蛋白APE1通过与DNA-PKcs相互结合进而从翻译后修饰的水平调控DNA-PKcs的激酶活性及其功能,且该调控过程依赖于APE1 redox功能。2.细胞在有丝分裂过程中,DNA-PKcs与hn RNPA1之间的亲和力最强,通过DNA-PKcs的C末端PIKK调控结构域与hn RNPA1的RRMs结构域相互结合。3.DNA-PKcs的PIKK结构域具有底物磷酸化的功能,可对位于hn RNPA1的RRMs结构域内第95和192位丝氨酸进行磷酸化修饰。4.hn RNPA1在有丝分裂期发生过度磷酸化以后,可高效地募集至端粒单链DNA上。5.细胞在有丝分裂过程中,过度磷酸化的hn RNPA1通过高效地移除端粒单链DNA上单链结合蛋白RPA,以及有效地促进POT1与端粒单链DNA结合,进而避免DDR通路上游的关键激酶ATR被RPA激活。6.过度磷酸化的hn RNPA1能够充分地抑制有丝分裂期端粒区域的DDR,并且有效地防止端粒融合、丢失等异常情况的发生。
【关键词】：基因组不稳定 细胞周期 端粒 DNA损伤反应 氧化还原 磷酸化 单链DNA 脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶 DNA依赖性蛋白激酶 核不均一核糖核蛋白A1 复制蛋白A 端粒保护蛋白1 共济失调毛细血管扩张突变和Rad3相关激酶
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q253;Q756
【目录】：
- 缩略语表4-7
- 英文摘要7-11
- 中文摘要11-14
- 第一章 前言14-18
- 第二章 APE1氧化还原功能对DNA-PKcs激酶活性的影响18-39
- 2.1 材料与方法18-30
- 2.2 结果30-37
- 2.3 讨论37-39
- 第三章 DNA-PKcs激酶介导有丝分裂期hnRNPA1磷酸化的机制研究39-85
- 3.1 材料与方法39-66
- 3.2 结果66-82
- 3.3 讨论82-85
- 第四章 hnRNPA1磷酸化促进其对有丝分裂期端粒的保护作用85-112
- 4.1 材料与方法85-99
- 4.2 结果99-109
- 4.3 讨论109-112
- 全文结论112-113
- 参考文献113-119
- 文献综述 Shelterin复合物如何保护哺乳动物端粒119-128
- 参考文献124-128
- 攻读学位期间的研究成果128-130
- 致谢130
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，本文编号：379153
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