线粒体动态管化介导线粒体网络形成

发布时间：2023-05-07 00:33

　　线粒体是形态学上高度动态的细胞器,它会形成管网状的线粒体网络。线粒体网络的形成对于线粒体维持其DNA的完整性,以及线粒体内容物的互相交换至关重要。破坏线粒体网络的形成影响线粒体呼吸等诸多功能。研究表明,线粒体网络的形成是依赖于单个线粒体之间的互相融合。在本文的工作中,我们发现了一种新的线粒体动态行为,命名为“线粒体动态管化”,并揭示了线粒体动态管化是线粒体形成网络的重要补充机制。我们在NRK细胞中将KIF5B敲除之后,线粒体网络会聚集在核周,细胞外围完全没有线粒体分布。当在该细胞中以诱导表达的方式放回KIF5B之后,KIF5B可以介导发生动态管化,向外拉出细长的线粒体细管,这些线粒体细管通过Mitofusin介导而互相融合,不停重复这个过程使线粒体网络的边界不断向外延展并最终占满整个细胞质。我们使用纯化的线粒体、KIF5B蛋白和体外聚合的微管在体外重构了线粒体动态管化过程和体外线粒体网络,并使用该系统证明了KIF5B介导的线粒体动态管化和Mitofusin介导的线粒体融合一起促使了体外线粒体网络的形成。有趣的是KIF5B只调控细胞外围的线粒体网络形成,这表明存在其他机制负责核周的线粒体...

【文章页数】：119 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
主要符号对照表
第1章 引言
    1.1 线粒体网络形成
        1.1.1 线粒体在形态学上的高度动态性
        1.1.2 线粒体网络形成
    1.2 线粒体融合
        1.2.1 线粒体外膜融合蛋白Mitofusin 1 和Mitofusin 2
        1.2.2 内膜融合蛋白OPA1
        1.2.3 线粒体融合的分子机制
    1.3 线粒体分裂
        1.3.1 线粒体分裂核心蛋白Drp1
        1.3.2 Drp1受体Fis1
        1.3.3 Drp1受体Mff
        1.3.4 MiD49和MiD51
    1.4 线粒体运动
        1.4.1 线粒体运动的分子机器
        1.4.2 正向运输马达蛋白
        1.4.3 马达蛋白适配器蛋白
        1.4.4 逆向运输马达蛋白
        1.4.5 马达蛋白之间的相互影响
        1.4.6 线粒体短程运动
        1.4.7 线粒体驻停
    1.5 线粒体动态变化的生理意义
        1.5.1 内容物混合
        1.5.2 线粒体DNA稳定性
        1.5.3 呼吸功能
        1.5.4 线粒体分裂促进细胞凋亡
        1.5.5 对细胞压力的适应
    1.6 线粒体动态变化与人类疾病
        1.6.1 常染色体显性视神经萎缩（ DOA）
        1.6.2 2A型腓骨肌萎缩（ CMT2A）
        1.6.3 新生儿致死
    1.7 特殊的细胞器膜形变：管化
    1.8 本论文研究的目的和意义
第2章 材料与方法
    2.1 抗体、质粒与试剂
    2.2 实验仪器
    2.3 NRK细胞mRNA提取和cDNA制备
        2.3.1 mRNA提取
        2.3.2 反转录制备cDNA
    2.4 细胞培养和电转
        2.4.1 细胞培养
        2.4.2 细胞电转
    2.5 TOM20-GFP和Mito-YFP稳定表达细胞系构建
    2.6 构建KIF5B敲除的NRK细胞系
        2.6.1 引物设计
        2.6.2 引物退火
        2.6.3 酶切酶连
        2.6.4 转化和测序
        2.6.5 转入哺乳动物细胞
        2.6.6 初步检测
        2.6.7 单克隆检测
    2.7 构建四环素诱导型KIF5B表达细胞系
    2.8 线粒体提取
    2.9 蛋白表达、纯化和标记
        2.9.1 表达质粒的构建
        2.9.2 蓝白斑筛选阳性克隆
        2.9.3 制备第一代病毒
        2.9.4 制备第二代病毒
        2.9.5 感染昆虫细胞
        2.9.6 蛋白提取
        2.9.7 蛋白标记
    2.10 体外实验小室的制作
        2.10.1 净化清洗缸
        2.10.2 清洗玻片
        2.10.4 小室制作
        2.10.5 质量检测
    2.11 免疫荧光染色
    2.12 细胞分级分离实验
    2.13 蛋白免疫印迹
    2.14 微管滑行实验
    2.15 体外重构线粒体管化过程
    2.16 数据统计
    2.17 场发射扫描电镜
第3章 线粒体动态管化的发现
    3.1 本章引论
    3.2 实验结果
        3.2.1 线粒体细丝
        3.2.2 线粒体动态管化的发现
        3.2.3 线粒体动态管化的性质和特点
        3.2.4 线粒体动态管化的普遍性
        3.2.5 线粒体动态管化沿着微管发生
        3.2.6 线粒体动态管化介导线粒体融合
    3.3 本章小结
第4章 KIF5B敲除和诱导表达系统
    4.1 本章引论
    4.2 实验结果
        4.2.1 构建KIF5B敲除的NRK细胞系
        4.2.2 构建四环素诱导型KIF5B表达细胞系
    4.3 本章小结
第5章 KIF5B通过多步骤介导细胞外围线粒体网络形成
    5.1 本章引论
    5.2 实验结果
        5.2.1 KIF5B分三步介导细胞外围线粒体网络形成
        5.2.2 KIF5B表达引起线粒体向细胞外围方向高频动态管化
        5.2.3 融合致使线粒体细管直径增加和稳定
        5.2.4 动态管化不断扩张线粒体网格
        5.2.5 已形成的网格处在高度动态变化中
    5.3 本章小结
第6章 KIF5B与线粒体相互作用
    6.1 本章引论
    6.2 实验结果
        6.2.1 KIF5B与线粒体在体内共定位
        6.2.2 KIF5B和线粒体在体外相互作用
    6.3 本章小结
第7章搭建体外线粒体管化系统
    7.1 本章引论
    7.2 实验结果
        7.2.1 体外重构系统的搭建
        7.2.2 体外重构线粒体动态管化
        7.2.3 体外线粒体动态管化沿着微管发生
    7.3 本章小结
第8章 KIF5B在体外系统中介导线粒体网络形成
    8.1 本章引论
    8.2 实验结果
        8.2.1 KIF5B介导线粒体在体外形成网络
        8.2.2 KI5B介导体内和体外线粒体网络形成的过程高度相似
    8.3 本章小结
第9章 KIF5B介导线粒体网络形成需要Mitofusins
    9.1 本章引论
    9.2 实验结果
        9.2.1 GTP促使线粒体在体外形成超级网络
        9.2.2 Mitofusins缺失不影响动态管化但线粒体不能形成网络
        9.2.3 Mitofusins缺失的线粒体在体外不能形成线粒体网络
    9.3 本章小结
第10章 讨论与展望
    10.1 论文工作总结与讨论
    10.2 展望
        10.2.1 线粒体直径调控和分叉形成
        10.2.2 线粒体形态与功能之间的关系
        10.2.3 细胞内圈线粒体网络的形成机制
        10.2.4 线粒体动态管化参与线粒体分裂
        10.2.5 线粒体动态管化与MDV形成
        10.2.6 线粒体之间信号通讯和物质交换
        10.2.7 线粒体动态管化和线粒体融合之间的反馈机制
        10.2.8 线粒体体外实验系统的广泛应用前景
参考文献
致谢
个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果



本文编号：3809901