基于稳定同位素双甲基化标记的动植物组织的定量蛋白质组学研究

发布时间：2017-05-21 09:08

  本文关键词：基于稳定同位素双甲基化标记的动植物组织的定量蛋白质组学研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：稳定同位素标记的双甲基化(Stable isotope dimethyl labeling)定量技术是一种化学标记技术,它的基本原理是在所有肽段的N端和赖氨酸的侧链上加上一个双甲基化标记,通过给双甲基引入稳定同位素,在一级质谱中形成一对存在质量偏移的同位素峰。稳定同位素标记的双甲基化定量技术具有价格便宜,操作简单,标记效率高的优点,由于其是在肽段水平标记,所以双甲基化标记几乎能应用到任何生物学样品中,特别是动植物组织学样品。在本文的第一部分工作中,我们应用双甲基化标记技术比较了红莲杂交水稻细胞质雄性不育系YtA和可育系YtB线粒体的全蛋白质组和蛋白质复合体组的差异。通过研究,我们发现红莲杂交水稻不育系YtA和可育系YtB中线粒体全蛋白的含量没有显著改变,但是线粒体中蛋白质复合体的含量在不育系YtA中呈现显著下调的趋势。经过酶活检测和线粒体的亚显微结构观察,我们发现不育系YtA线粒体中呼吸链复合体的酶学活性显著降低,线粒体的形态也发生了显著改变。这些结果都表明在细胞质雄性不育(CMS)的水稻线粒体中,线粒体蛋白的含量没有显著改变,但是线粒体中功能性的复合体蛋白,特别是呼吸链复合体蛋白的含量显著下降,揭示细胞质雄性不育(CMS)的水稻线粒体可能存在复合体装配的问题。另外,我们也发现不育系YtA中茉莉酸生物合成通路的异常。在本文的第二部分工作中,我们应用双甲基化标记技术比较了大鼠视网膜缺血再灌注(Ischemia and reperfusion, I/R)模型中的蛋白质组学变化。在全部1088个定量蛋白中,234个蛋白(～22%)表现出1.5倍以上的上下调,其中194个蛋白上调,40个蛋白下调。基因归类(Gene Ontology, GO)和统计学的评估表明在I/R损伤过后,代谢过程(metabolic process)相关蛋白呈现上调趋势,而细胞通讯(cell communication)、系统过程(system process)和转运过程(transport)相关蛋白呈现下调趋势。这一结果暗示I/R损伤后机体表现出增强对于生存至关重要的代谢过程而减弱细胞功能性的生物学过程。通过STRING蛋白相互作用网络分析,我们发现了显著上调的核糖体蛋白和分泌蛋白(包含许多蛋白酶抑制剂)作用网络。虽然这一结果暗示机体内的蛋白合成呈现上调趋势,但是我们发现与蛋白合成激活相关的mTOR (mammalian target of rapamycin)通路却是在I/R损伤之后被抑制的。在下调的蛋白相互作用网络中,我们发现了突触相关蛋白显著下调,后续的实验验证了这一现象,暗示I/R损伤之后大鼠视网膜存在功能性突触的减少。在本文的第三部分工作中,我们应用双甲基化标记技术比较了肝脏特异性的泛素连接酶gp78基因敲除小鼠中肝脏蛋白质组学的变化。在雄性小鼠的两组生物学重复实验中,我们总共定量了3193个蛋白,其中2088个蛋白为两组共同定量蛋白。在这2088个定量蛋白当中,42个蛋白呈现出显著的上下调(1.5倍变化)。通过生物信息学分析,我们发现这42个蛋白中含有较多的代谢相关的酶,其中与脂质代谢相关的酶呈现显著下调的趋势。这一结果表明,gp78基因敲除后,小鼠肝脏中的脂质代谢是受到抑制的。
【关键词】：稳定同位素的双甲基化标记 细胞质雄性不育 复合体蛋白 茉莉酸生物合成通路 缺血再灌注 核糖体蛋白 mTOR通路 突触相关蛋白 肝脏特异性的gp78基因敲除小鼠 脂质代谢
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q51
【目录】：

• 本研究主要创新点5-8
• 摘要8-10
• Abastract10-12
• 第一章 绪论12-25
• 1.1 蛋白质组学简介12-15
• 1.1.1 蛋白质组学概述及其发展12-13
• 1.1.2 蛋白质组学研究技术的简介13-15
• 1.2 基于质谱的定量蛋白质组学简介15-22
• 1.2.1 细胞培养条件下的稳定同位素标记技术(SILAC)16-17
• 1.2.2 等质量标签标记定量技术(iTRAQ和TMT)17-19
• 1.2.3 蛋白质的绝对定量技术(AQUA)19-20
• 1.2.4 无标记定量技术(Label free)20-22
• 1.2.5 选择性质谱反应监控定量技术(SRM)22
• 1.3 稳定同位素标记的双甲基化定量技术22-25
• 第二章 基于双甲基化定量的红莲杂交水稻线粒体蛋白质组学研究25-46
• 2.1 前言25-26
• 2.2 材料与方法26-33
• 2.2.1 材料26
• 2.2.2 水稻线粒体的提取26-27
• 2.2.3 BN-PAGE分离线粒体蛋白复合体27-28
• 2.2.4 BN-PAGE分离的线粒体蛋白复合体的胶内酶解28
• 2.2.5 水稻线粒体总蛋白的溶液内酶解28-29
• 2.2.6 水稻线粒体总蛋白溶液内酶解后肽段的脱盐29
• 2.2.7 双甲基化标记线粒体肽段29-30
• 2.2.8 强阳离子交换色谱(SCX)分离30
• 2.2.9 QSTAR Elite质谱分析30-31
• 2.2.10 质谱数据的搜库及分析31
• 2.2.11 线粒体蛋白复合体的Western blots分析31
• 2.2.12 水稻线粒体呼吸链复合体的酶活检测31-32
• 2.2.13 水稻线粒体形态学的电镜检测32
• 2.2.14 茉莉酸及其生物合成前体的定量检测32-33
• 2.3 实验结果33-44
• 2.3.1 红莲杂交水稻线粒体的全蛋白质组学和复合体组学实验流程33-35
• 2.3.2 红莲杂交水稻不育系和可育系的线粒体比较蛋白质组学分析35-38
• 2.3.3 线粒体中复合体蛋白含量的分析38-40
• 2.3.4 线粒体中呼吸链复合体蛋白的酶活检测40
• 2.3.5 不育系YtA和可育系YtB线粒体的形态学检测40-41
• 2.3.6 不育系YtA和可育系YtB水稻中茉莉酸合成通路的检测41-44
• 2.3.7 ROS相关的线粒体蛋白显著上调44
• 2.4 讨论与展望44-46
• 第三章 基于双甲基化定量的视网膜I/R损伤机制的蛋白质组学研究46-76
• 3.1 前言46-47
• 3.2 材料与方法47-54
• 3.2.1 材料47
• 3.2.2 大鼠视网膜I/R损伤模型的建立47-48
• 3.2.3 体外细胞(SH-SY5Y)I/R损伤模型的建立48
• 3.2.4 大鼠视网膜蛋白和SH-SY5Y细胞蛋白的提取48
• 3.2.5 正常组和I/R处理组的大鼠视网膜蛋白的溶液内酶解48-49
• 3.2.6 正常组和I/R处理组的大鼠视网膜蛋白溶液内酶解后的脱盐49-50
• 3.2.7 正常组和I/R处理组的大鼠视网膜蛋白的双甲基化标记50
• 3.2.8 强阳离子交换色谱(SCX)分离双甲基化标记的大鼠视网膜I/R样品50-51
• 3.2.9 双甲基化标记的大鼠视网膜I/R处理的样品的质谱分析51
• 3.2.10 质谱数据的搜库及定量51
• 3.2.11 生物信息学分析51-52
• 3.2.12 Western Blots分析52-53
• 3.2.13 视网膜的形态学检测和免疫荧光染色53-54
• 3.3 实验结果54-73
• 3.3.1 大鼠视网膜I/R损伤前后的比较蛋白质组学分析54-62
• 3.3.2 大鼠视网膜I/R损伤前后蛋白质的生物学过程(biological process)分析62-65
• 3.3.3 大鼠视网膜I/R损伤前后显著变化蛋白的作用网络分析65-68
• 3.3.4 大鼠视网膜I/R损伤模型的定量蛋白质组学结果的Western blots验证68-70
• 3.3.5 大鼠视网膜I/R损伤诱导突触相关蛋白的减少70-71
• 3.3.6 大鼠视网膜I/R损伤诱导核糖体蛋白的累积和mTOR通路的抑制71-73
• 3.4 讨论与展望73-76
• 第四章 基于双甲基化定量的gp78基因敲除小鼠的蛋白质组学研究76-96
• 4.1 前言76-79
• 4.2 材料与方法79-83
• 4.2.1 材料79
• 4.2.2 正常小鼠和gp78基因敲除小鼠肝脏蛋白的提取79-80
• 4.2.3 正常小鼠和gp78基因敲除小鼠肝脏蛋白的溶液内酶解80
• 4.2.4 正常组和gp78基因敲除小鼠肝脏蛋白溶液内酶解后的脱盐80-81
• 4.2.5 正常组和gp78基因敲除小鼠肝脏蛋白的双甲基化标记81
• 4.2.6 正常组和gp78基因敲除小鼠混合肽段的强阳离子交换色谱分离81-82
• 4.2.7 正常组和gp78基因敲除小鼠双甲基化标记的混合样品的质谱分析82
• 4.2.8 质谱数据的搜库及定量82-83
• 4.2.9 生物信息学分析83
• 4.3 实验结果83-94
• 4.3.1 小鼠泛素连接酶gp78基因敲除效果的检测83-84
• 4.3.2 gp78基因敲除小鼠肝脏的比较蛋白质组学实验流程84-86
• 4.3.3 gp78基因敲除小鼠肝脏的比较蛋白质组学结果86-90
• 4.3.4 gp78基因敲除小鼠肝脏蛋白组学的基因归类分析90-92
• 4.3.5 gp78基因敲除小鼠肝脏蛋白组学的STRING分析92-94
• 4.4 讨论与展望94-96
• 第五章 总结及展望96-97
• 参考文献97-105
• 博士期间已发表和待发表的学术论文105-106
• 致谢106

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本文编号：383197