蛋白翻译起始核心复合物的O-GlcNAc糖基化修饰调控蛋白合成机制

发布时间：2023-08-26 00:07

　　蛋白合成在细胞的生长、繁殖和生存过程中起着至关重要的作用。细胞内的蛋白合成过程受到严格的调控。蛋白翻译失调被认为是肿瘤的特征之一。蛋白翻译起始是整个蛋白合成的限速步骤,而eIF4F复合物参与的43S复合物的装配是蛋白翻译起始的限速步骤,所以eIF4F复合物的调控对于整个蛋白翻译的效率的调节起着重要的作用,因此eIF4F复合物通常被作为肿瘤治疗的药物靶点。eIF4F复合物主要由eIF4A、eIF4E和eIF4G组成,其中eIF4E的调控机制及药物靶点研究较为成熟,而eIF4A和eIF4G的调控机制有待进一步被阐明。O-GlcNAc糖基化修饰是通过β-D-N-乙酰葡糖胺共价连接到蛋白质的丝氨酸或苏氨酸羟基上的一种细胞内蛋白翻译后修饰。目前已发现鉴定1000多种具有O-GlcNAc糖基化修饰的蛋白,越来越多的证据表明,O-GlcNAc糖基化修饰调节各种重要的生物学过程,包括转录、干细胞分化、信号转导、细胞周期进程和代谢重编程等。O-GlcNAc糖基化紊乱能够导致II型糖尿病、神经退化性疾病、阿尔兹海默氏病、肿瘤等多种重大疾病的发生。过去几年的研究表明O-GlcNAc糖基化修饰能够直接或间接调...

【文章页数】：126 页

【学位级别】：博士

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致谢
摘要
abstract
缩写对照表
第一章 综述
    1.1 蛋白翻译起始概述
        1.1.1 蛋白质生物合成
        1.1.2 蛋白翻译起始
        1.1.3 蛋白翻译起始因子
        1.1.4 eIF4F复合物
        1.1.5 eIF4F复合物的调控
        1.1.6 eIF4F复合物的失调与肿瘤
        1.1.7 eIF4F复合物可作为肿瘤治疗的靶点
    1.2 O-GlcNAc糖基化修饰概述
        1.2.1 HBP途径与营养感受器
        1.2.2 OGA与 OGT
        1.2.3 O-GlcNAc糖基化修饰与肿瘤
        1.2.4 O-GlcNAc糖基化修饰作为肿瘤治疗的靶点
立题依据和意义
第二章 eIF4AI的 O-GlcNAc糖基化修饰调控蛋白合成机制
    2.1 材料与方法
        2.1.1 核酸序列
        2.1.2 主要试剂和仪器
        2.1.3 主要缓冲液配方
        2.1.4 细胞培养与肿瘤组织
        2.1.5 表达质粒的构建
        2.1.6 eIF4G1和e IF4A基因突变表达载体的构建
        2.1.7 shRNA载体的构建
        2.1.8 去内毒素质粒的提取
        2.1.9 细胞转染
        2.1.10 慢病毒的制备及细胞感染
        2.1.11 蛋白表达与纯化
        2.1.12 Western Blot
        2.1.13 O-GlcNAc糖基化修饰的检测
        2.1.14 细胞内蛋白合成测定
        2.1.15 体外蛋白合成测定
        2.1.16 多核糖体检测实验
        2.1.17 eIF4AI的解螺旋酶活性测定
        2.1.18 m7GDP亲和层析实验
        2.1.19 细胞增殖实验
        2.1.20 软琼脂细胞克隆形成实验
        2.1.21 裸鼠移植瘤形成实验
        2.1.22 数据统计分析
    2.2 结果与分析
        2.2.1 OGT能与细胞内的e IF4F复合物相互作用
        2.2.2 eIF4F复合物中的e IF4AI和 eIF4GI存在O-GlcNAc糖基化修饰
        2.2.3 eIF4AI是在细胞蛋白翻译过程中发挥主要功能的eIF4A基因剪接体
        2.2.4 eIF4AI的糖基化修饰受细胞内的营养状态动态调控
        2.2.5 肿瘤细胞中的eIF4AI的糖基化水平降低
        2.2.6 eIF4AI的丝氨酸322 位和323 位是主要的O-GlcNAc糖基化位点
        2.2.7 eIF4AI的 O-GlcNAc糖基化修饰干扰了eIF4F复合物的装配
        2.2.8 提高e IF4AI的 O-GlcNAc糖基化抑制了eIF4AI与 eIF4GI的互作
        2.2.9 细胞内的营养状态影响了eIF4AI与 eIF4GI的互作
        2.2.10 细胞内的营养状态影响了eIF4AI与内源的eIF4GI的互作
        2.2.11 eIF4AI的 O-GlcNAc糖基化修饰抑制了其解旋酶活性
        2.2.12 eIF4AI的 O-GlcNAc糖基化修饰抑制体外的蛋白合成效率
        2.2.13 eIF4AI的 O-GlcNAc糖基化修饰抑制了细胞内的蛋白合成效率
        2.2.14 构建稳定的WT、S322/S323A和 S322/S323Y的eIF4AI补救的A2780 细胞系
        2.2.15 eIF4AI的 O-GlcNAc糖基化修饰抑制了卵巢癌细胞的繁殖
        2.2.16 eIF4AI的 O-GlcNAc糖基化修饰抑制了裸鼠中卵巢癌细胞的成瘤
        2.2.17 卵巢癌组织样品中的OGT、OGA含量和总体的O-GlcNAc糖基化修饰检测
        2.2.18 卵巢癌组织样品中的eIF4AI的糖基化水平下调
    2.3 小结
第三章 eIF4GI的 O-GlcNAc糖基化修饰调控蛋白合成机制
    3.1 材料与方法
        3.1.1 核酸序列
        3.1.2 主要试剂和仪器
        3.1.3 细胞培养与肿瘤组织
        3.1.4 CRISPR-Cas9介导的基因敲入
        3.1.5 荧光各向异性实验
        3.1.6 可剪切的蛋白交联实验
        3.1.7 细胞周期同步化和流式检测
        3.1.8 免疫共沉淀实验
        3.1.9 MCF-7 细胞裸鼠移植瘤形成实验
    3.2 结果与分析
        3.2.1 eIF4GI是在细胞蛋白翻译过程中发挥主要功能的剪接体
        3.2.2 eIF4GI的糖基化修饰受细胞内的营养状态动态调控
        3.2.3 肿瘤细胞中e IF4GI的糖基化水平呈现升高趋势
        3.2.4 S61是e IF4GI的主要O-GlcNAc糖基化修饰位点
        3.2.5 eIF4GI的 O-GlcNAc糖基化修饰促进了eIF4GI与内源PABP的相互作用
        3.3.6 eIF4GI的 O-GlcNAc糖基化修饰缺失抑制了eIF4GI与 PABP的相互作用
        3.3.7 高糖条件培养促进了内源的eIF4GI与 PABP的相互作用
        3.2.8 eIF4GI的 O-GlcNAc糖基化修饰促进了eIF4GI与 m RNA的相互作用
        3.2.9 产生e IF4GI S61A突变的MCF-7 细胞系
        3.2.10 MCF-7 细胞中经TMG处理后eIF4GI的 O-GlcNAc糖基化水平变化
        3.2.11 eIF4GI的 O-GlcNAc糖基化修饰促进了MCF-7 细胞内源eIF4GI与 PABP的相互作用
        3.2.12 eIF4GI的 O-GlcNAc糖基化修饰促进了乳腺癌细胞的蛋白合成
        3.2.13 eIF4GI的 S61 位糖基化缺失抑制了多聚核糖体的形成
        3.2.14 eIF4GI的 O-GlcNAc糖基化修饰促进了乳腺癌细胞的生长
        3.2.15 eIF4GI的 S61 位糖基化缺失抑制了细胞的单克隆形成能力
        3.2.16 eIF4GI的 S61 位糖基化修饰促进了乳腺癌细胞的肿瘤形成能力
        3.2.17 乳腺癌组织样品中的OGT的含量和总体的O-GlcNAc糖基化修饰检测
        3.2.18 在乳腺癌组织中e IF4GI的糖基化水平升高
        3.2.19 在细胞周期进程中,eIF4AI和 eIF4GI的糖基化修饰存在动态变化
    3.3 小结
第四章 总结与讨论
    4.1 总结
    4.2 讨论
    4.3 创新点
参考文献
个人简介



本文编号：3843563