CRISPR/CAS系统介导的基因组大片段DNA编辑

发布时间：2023-10-12 03:27

　　随着测序技术以及大数据信息科学的发展,越来越多导致疾病的基因突变已经被发现。不仅如此,如今的技术已经可以预测一些疾病的发生可能与基因组上哪些DNA突变相关。然而,需要验证预测的结果,或是对已经发生的基因突变进行治疗,就必须依靠基因编辑技术。传统的基因改造技术以基因打靶或是化学诱变(如乙烷亚硝基脲)为主。前者依赖于胚胎干细胞自发性同源重组反应,而后者通过诱导随机性的突变进而再筛选出需要的突变。两者都需要投入相当的时间和精力,况且有些物种还没有完整的胚胎干细胞培养体系,难以在日常的研究中广泛使用。近十年来,ZFN和TALEN人工核酸酶的出现改变了整个基因编辑领域过去的面貌。相对传统的基因打靶技术,ZFN和TALEN能够快速地引起双链DNA的断链,而这种DNA损伤既能够大大提高细胞内自发同源重组发生的概率,也能够简单地敲除某一基因。通过向胚胎注射能结合目的序列的ZFN或TALEN的mRNA,人们曾突破性地成功在大鼠体内实现了定点基因编辑。然而ZFN的特异有时受到相邻模块的影响,TALEN的DNA结合域存在大量的重复序列,给载体的构建带来相当的难度。就在TALEN技术出现后不久CRISPR/C...

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摘要
Abstract
前言
第一章 体外表达重组Cas9蛋白以及活性检测
    一 引言
    二 材料与方法
        2.1 主要实验试剂与仪器
        2.2 实验方法
    三 结果与讨论
        3.1 His6-Cas9重组蛋白的体外纯化
        3.2 His6MBP-Cas9重组蛋白的体外纯化
        3.3 通过离子交换柱纯化His6MBP-Cas9
        3.4 体外重组Cas9蛋白的功能鉴定
    四 结语
第二章 利用Cas9蛋白构建带有点突变的小鼠
    一 引言
    二 材料与方法
        2.1 主要实验试剂与仪器
        2.2 实验方法
    三 结果与讨论
        3.1 His6-Cas9蛋白介导的点突变
        3.2 F1代小鼠基因型的鉴定
        3.3 重组ffis6-Cas9体内脱靴活性的检测
    四 结语
第三章 利用重组Cas9蛋白敲除基因组中长片段DNA
    一 引言
    二 材料与方法
        2.1 主要实验试剂及仪器
        2.2 实验方法
    三 结果与讨论
        3.1 大鼠Fah基因的敲除
        3.2 小鼠体内大片段DNA的敲除
    四 结语
第四章 Cas9蛋白介导的长片段DNA的整合及功能的鉴定
    一 引言
    二 材料与方法
        2.1 主要实验试剂与仪器
        2.2 实验方法
    三 结果与讨论
        3.1 在Nfac1位点插入IRES-CreERT2-polyA及其功能的鉴定
        3.2 在大鼠的Lgr5位点插入Gene trap元件SA-GFP-pA并验证其功能
    四 结语
第五章 问题与展望
第六章 综述
参考文献
科研成果
致谢



本文编号：3853359