布鲁氏菌二元调控系统TceSR和TcfSR的生物学功能研究

发布时间：2017-05-29 11:07

  本文关键词：布鲁氏菌二元调控系统TceSR和TcfSR的生物学功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：布鲁氏菌病是由感染人和动物的布鲁氏菌造成的对社会安全有严重危害的疾病,在世界上广泛流行,尤其是在发展中国家,造成更为严重的经济损失。布鲁氏菌是一类兼性胞内寄生菌,其毒力主要依赖于在宿主细胞内的生存和繁殖的能力。二元调控系统(two-component regulatory system,TCS)能够对环境信号感受应答、传递以及处理的信号进行转导、调节和控制。布鲁氏菌有15对TCS,已有研究表明,位于染色体I的TCS与布鲁氏菌的毒力密切相关,但位于染色体II的TCS的毒力表型及其调控机制还尚不清楚。本研究以布鲁氏菌TCS TceSR和TcfSR为研究对象,通过探讨TCS TceSR和TcfSR对布鲁氏菌毒力表型、相关基因表达和胞内生存繁殖的影响,及其在小鼠体内的毒力和免疫保护力,为揭示布鲁氏菌感染宿主细胞的分子机制提供线索,也为新疫苗的研发、相关疫病的预防、控制和抗病育种工作提供依据。目的:本研究以羊种布鲁氏菌参考株16M为研究对象,探讨TCS TceSR和TcfSR的功能及其在布鲁氏菌致病过程中的作用机制。(1)构建TCS TceSR和TcfSR启动子失活的突变株,并对其进行鉴定。(2)分析TCS TceSR和TcfSR突变株相关毒力基因的胞内外转录水平,比较突变株和亲本株毒力基因表达的差异,根据差异基因的功能及其在突变株中的转录变化,解释突变株相关毒力表型的变化。(3)分析比较突变株和亲本株胞内生存相关表型的差异,确定TCS TceSR和TcfSR对布鲁氏菌胞内存活的作用。(4)分析突变株在小鼠体内的毒力,探讨TCS TceSR和TcfSR对布鲁氏菌在小鼠体内建立慢性感染的作用。方法:(1)利用同源重组和抗性替换的方法,构建了TCS TceSR和TcfSR启动子失活的突变株;对获得的基因突变株进行PCR鉴定和遗传稳定性检测。(2)布鲁氏菌侵染巨噬细胞RAW264.7,qRT-PCR检测布鲁氏菌相关毒力基因(主要包括脂多糖合成相关蛋白、外膜蛋白、Ⅳ型分泌系统、转运系统、鞭毛系统、调控系统、压力蛋白/泛素相关蛋白、氮源代谢分子)的胞内转录水平;亲本株和突变株在体外刺激环境中培养30min。利用qRT-PCR分析毒力基因omp25、virB1、vjbR、gntR、dnaK、Hfq、htrA的转录变化。(3)比较突变株和亲本株的胞内存活相关表型。布鲁氏菌侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7,在侵染后不同时间,检测细菌的黏附侵袭能力和胞内存活能力;亲本株和突变株侵染巨噬细胞RAW264.7,利用荧光定量PCR、流式细胞仪和共聚焦显微镜测定宿主细胞在细菌的侵袭下所引起的凋亡和自噬水平;构建能够表达绿色荧光的布鲁氏菌,侵染巨噬细胞RAW264.7,观察布鲁氏菌与溶酶体的融合情况。(4)用布鲁氏菌疫苗株和突变株分别腹腔接种免疫(106CFU)SPF级4-6周龄雌性BALB/c小鼠;接种后的不同时间点采集免疫小鼠血清,采用间接ELISA测定小鼠体内细胞因子IFN-γ的水平和总的IgG水平;无菌分离脾脏,测定脾脏载菌量,制备病理切片,检测突变株的毒力;用105CFU的16M进行攻毒实验,检测各菌株的保护力;克隆、表达、纯化TCES和TCFS两个蛋白,以纯化的蛋白作为抗原,分别对突变株免疫小鼠的血清进行Western Blot分析。结果:(1)成功构建了TCS TceSR和TcfSR启动子突变株16MΔTceSR和16MΔTcfSR,在15代内遗传性稳定;突变株和亲本株的体外生长趋势一致;体外刺激结果显示,突变株对酸、碱、高盐、热应激、营养缺陷和干燥的抵抗力降低。(2)亲本株和突变株侵染细胞24h后,66个布鲁氏菌相关毒力基因在胞内的转录水平发生了变化,其中在16MΔTceSR突变株中,41个(62.12%)基因高表达,25个(37.88%)基因低表达;在16MΔTcfSR突变株中,47个(71.21%)基因高表达,19(28.79%)个基因低表达;在体外刺激环境下,布鲁氏菌胞内存活相关的基因在突变株中的转录水平均低于在亲本株中的转录水平。(3)突变株对细胞的粘附能力和胞内存活能力是减弱的;细胞凋亡研究发现,突变株与亲本株引起宿主细胞凋亡程度相似;而细胞自噬结果却发现,突变株引起细胞自噬水平低于亲本株;溶酶体融合实验显示,侵染细胞24h时突变株组胞内的布氏小体与溶酶体融合率高于亲本株组。(4)突变株免疫小鼠后,可诱导机体分泌IFN-γ和IgG,小鼠脾脏载菌量低于亲本株,但仍存在一定的毒力;攻毒后,突变株免疫的小鼠对亲本株可产生一定的免疫保护力;布鲁氏菌重组蛋白TCES和TCFS可以作为诊断抗原,鉴别突变株免疫和亲本株免疫的小鼠。结论:(1)TCS TceSR和TcfSR在布鲁氏菌抵抗逆环境中有重要的作用。(2)TCS TceSR和TcfSR突变株侵染宿主细胞后,66个毒力基因的表达受到了影响,使布鲁氏菌适应胞内的各种不利环境,以利于布鲁氏菌的胞内存活。(3)TCS TceSR和TcfSR突变株在小鼠体内可诱导细胞免疫和体液免疫,其毒力比亲本株下降明显,但需进一步改造。
【关键词】：布鲁氏菌 TCS TceSR和TcfSR 胞内存活 转录调控 免疫
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 中文摘要6-8
• Abstract8-14
• 英文缩略词表14-16
• 引言16-17
• 第一部分 文献综述 布鲁氏菌分子致病机制的研究进展17-41
• 1 布鲁氏菌病概述17-20
• 1.1 布鲁氏菌的种属特性17-18
• 1.2 布鲁氏菌病18-20
• 2 布鲁氏菌毒力的研究现状20-22
• 2.1 布鲁氏菌的基本生物学性状20
• 2.2 布鲁氏菌的基因组学研究20-21
• 2.3 布鲁氏菌的毒力因子21-22
• 3 布鲁氏菌的毒力调控系统22-28
• 3.1 二元调控系统22-23
• 3.2 Ⅳ型分泌系统23-25
• 3.3 密度感应系统25-26
• 3.4 磷酸转移酶系统26-27
• 3.5 小调控RNA和热休克蛋白27-28
• 4 布鲁氏菌胞内生存机制的研究28-39
• 4.1 布鲁氏菌可在不同宿主细胞中生存28-30
• 4.2 不同状态的布鲁氏菌的胞内生存30-32
• 4.3 布鲁氏菌对胞内生存环境的生理适应32-33
• 4.4 布鲁氏菌的胞内生存与宿主细胞凋亡的关系33
• 4.5 布鲁氏菌的胞内生存与宿主细胞自噬的关系33-35
• 4.6 布鲁氏菌的胞内生存与宿主细胞溶酶体融合的关系35-36
• 4.7 布鲁氏菌在胞内生存过程中对宿主免疫应答的调节36-39
• 5 本研究的目的和意义39-41
• 第二部分 实验研究41-129
• 实验一 TCS TceSR和TcfSR突变株的构建及鉴定41-63
• 摘要41
• 1 材料与方法41-50
• 1.1 材料41-42
• 1.2 方法42-50
• 2 结果50-60
• 2.1 目的基因N端与C端的扩增50-52
• 2.2 Kan抗性基因的扩增52
• 2.3 同源重组序列的融合52
• 2.4 突变株突变载体的构建52-53
• 2.5 突变株的筛选与鉴定53-56
• 2.6 缺失株 16MΔTceSR和 16MΔTcfSR的遗传稳定性检测56-57
• 2.7 生长曲线57-58
• 2.8 布鲁氏菌在体外应激条件下的生存能力58
• 2.9 体外刺激环境下的长期生存实验58-60
• 2.10布鲁氏菌的聚集现象60
• 3 讨论60-62
• 3.1 布鲁氏菌TCS TceSR和TcfSR的选择60-61
• 3.2 以T载体为自杀载体快速构建布鲁氏菌突变株61
• 3.3 布鲁氏菌电转化条件的优化61-62
• 3.4 TCS TceSR和TcfSR失活后对布鲁氏菌生长特性的影响62
• 3.5 TCS TceSR和TcfSR调控布鲁氏菌抵抗外界环境的刺激62
• 4 小结62-63
• 实验二 TCS TceSR和TcfSR功能失活后相关毒力基因表达分析63-89
• 摘要63-64
• 1 材料与方法64-69
• 1.1 材料64-67
• 1.2 方法67-69
• 2 结果69-85
• 2.1 引物的特异性分析69-70
• 2.2 胞内转录最佳侵染时间的确定70
• 2.3 差异基因表达分析70-81
• 2.4 体外刺激条件下目的基因的相对表达分析81-84
• 2.5 细菌在不同生长时期TCS TceSR和TcfSR对virB1和vjbR的调控作用84-85
• 3 讨论85-88
• 3.1 TceSR和TcfSR的胞内高效表达时间85
• 3.2 TCS TceSR和TcfSR功能缺失后相关毒力基因的胞内转录水平分析85
• 3.3 TCS TceSR和TcfSR功能缺失后胞内存活相关毒力基因的体外转录分析85-87
• 3.4 TCS TceSR和TcfSR与virB1和vjbR的调控关系87-88
• 4 小结88-89
• 实验三 TCS TceSR和TcfSR对布鲁氏菌胞内生存的影响89-109
• 摘要89
• 1 材料与方法89-94
• 1.1 材料90-91
• 1.2 方法91-94
• 2 结果94-105
• 2.1 布鲁氏菌对巨噬细胞的粘附侵袭能力94-95
• 2.2 布鲁氏菌在巨噬细胞内的存活能力95-96
• 2.3 16MΔTceSR和 16MΔTcfSR不诱导巨噬细胞发生凋亡96-101
• 2.4 16MΔTceSR和16MΔTcfSR诱导巨噬细胞发生不同水平的自噬101-104
• 2.5 16MΔTceSR和 16MΔTcfSR可促进溶酶体的融合104-105
• 3 讨论105-107
• 3.1 TCS TceSR和TcfSR对巨噬细胞的粘附侵袭能力的影响105
• 3.2 TCS TceSR和TcfSR对巨噬细胞内的生存能力的影响105-106
• 3.3 TCS TceSR和TcfSR对宿主细胞凋亡的影响106-107
• 3.4 TCS TceSR和TcfSR对宿主细胞自噬的影响107
• 3.5 TCS TceSR和TcfSR对胞内布鲁氏菌与溶酶体融合的影响107
• 4 小结107-109
• 实验四 TCS TceSR和TcfSR突变株的小鼠体内毒力分析及其对免疫的影响109-129
• 摘要109
• 1 材料与方法109-116
• 1.1 材料109-111
• 1.2 方法111-116
• 2 结果116-127
• 2.1 细胞免疫116-117
• 2.2 体液免疫117-118
• 2.3 小鼠脾脏CFU计数检测突变株的毒力118-119
• 2.4 组织病理学变化119-121
• 2.5 突变株的免疫保护作用121-122
• 2.6 Tces基因和Tcfs基因的扩增122-123
• 2.7 重组质粒的构建与鉴定123-124
• 2.8 TCES和TCFS重组蛋白的诱导表达124-125
• 2.9 TCES和TCFS重组蛋白表达形式的确定125-126
• 2.10 TCES和TCFS重组蛋白的纯化126-127
• 2.11 Western Blot分析127
• 3 讨论127-128
• 3.1 细胞免疫水平分析127
• 3.2 体液免疫水平分析127-128
• 3.3 突变株的毒力和保护力分析128
• 3.4 诊断抗原的反应原性分析128
• 4 小结128-129
• 第三部分 全文总结129-131
• 本研究的创新点131-132
• 参考文献132-155
• 附录一155-161
• 附录二161-175
• 致谢175-177
• 作者简介177-179
• 导师评阅表179

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 白耀霞;杨毅;王玉飞;王同坤;于爽;陈燕芬;付思美;黄留玉;田晋红;陈泽良;;利用T载体克隆快速构建布鲁氏菌缺失突变株[J];中国生物工程杂志;2010年09期

2 付思美;白耀霞;曲R，

本文编号：404753