利用体细胞核移植制备肾脏特异性表达Cre重组酶的转基因工具猪

发布时间：2017-06-07 21:09

  本文关键词：利用体细胞核移植制备肾脏特异性表达Cre重组酶的转基因工具猪，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：囊性肾脏疾病(PKD)是常染色体显性遗传疾病,在临床中较为常见,对人类健康构成重大威胁。科研人员期望通过动物模型揭示其致病机理。由于人和小鼠肾脏的生理学参数和解剖学特征显著不同,因此基因修饰小鼠模型并不能很好地阐述人类囊性肾脏疾病过程。而猪作为一种动物模型,其器官大小、结构,以及生理学参数更接近人类,尤其适用于研究人类疾病。Cre-lox P重组酶系统是目前比较常用的构建条件性基因敲除动物模型的基因修饰技术。Cre-lox P系统的应用主要依赖于构建时空特异性表达Cre重组酶的转基因动物。利用发育特定时期或特定组织表达Cre重组酶的转基因动物与lox P序列锚定目的基因的转基因动物杂交,其子代能够达到条件性基因敲除的目的。水通道蛋白(Aquaporin)是一个跨膜水分子运输通道蛋白。AQP2(Aquaporin2)属于水通道蛋白家族的一员,主要表达于哺乳动物肾脏组织。本研究利用8000bp大小的猪源AQP2启动子片段驱动Cre表达,构建肾脏表达Cre重组酶的转基因工具猪。首先,分析了中国实验用小型猪不同组织中AQP2表达情况,并利用体外实验检测了所构建AQP2-Cre表达载体的表达活性。结果显示,8000bp猪源AQP2启动子区序列能够驱动Cre重组酶在LLC-PK1细胞中高效表达。利用所构建AQP2-Cre表达载体转染中国实验用小型猪胎儿成纤维细胞,通过G418选择性培养基筛选12天,获得细胞克隆。PCR法鉴定细胞克隆后,利用体细胞核移植技术制备转基因克隆猪。分析结果表明,健康出生的2头猪均为阳性AQP2-Cre转基因小型猪。通过RT-PCR和Western Blotting证明转基因小型猪的肾脏组织中表达Cre重组酶,而在其他检测组织中不表达。免疫组织化学结果证表明,转基因小型猪的肾脏集合管细胞中表达Cre重组酶,而对照组正常小型猪没有Cre重组酶表达。结果证明,本实验成功制备了肾脏组织表达Cre重组酶的转基因小型猪。在Cre重组酶表达分析的基础上,我们进一步分离了AQP2-Cre转基因小型猪肾脏细胞,并转染检测Cre重组酶活性的p CAG-LNL-RFP载体。结果表明,AQP2-Cre转基因小型猪的肾脏细胞具有Cre重组酶活性,能够介导lox P序列之间的目的基因重组。利用q PCR和hi Tail-PCR分析了转基因猪中Cre编码序列的拷贝数以及整合位点。q PCR结果证明,在AQP2-Cre转基因小型猪中,Cre在不同组织的拷贝数为12-14;不同月龄转基因小型猪基因组中Cre拷贝数同样为12-14。统计学分析显示,在不同组织中以及不同月龄转基因小型猪Cre拷贝数无明显差异。Hi TAIL-PCR结果表明,转基因小型猪基因中共有6个AQP2-Cre的整合位点,它们随机分布于染色体上的调控区或编码区序列。基于本实验的结果,结合本实验之前的研究基础,本研究成功制备了AQP2-Cre转基因小型猪,该研究成果对制备敲除肾脏特异性基因猪模型奠定了坚实基础。
【关键词】：Cre-loxp AQP2 体细胞核移植 转基因猪 肾脏特异性
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q78;R692;R-332
【目录】：

• 摘要4-6
• abstract6-13
• 前言13-15
• 第一篇 文献综述15-27
• 第1章 囊性肾脏疾病与基因条件性敲除的研究进展15-21
• 1.1 囊性肾病的分类15
• 1.2 多囊肾疾病分类15-16
• 1.3 多囊肾疾病的相关研究16-17
• 1.4 Cre/loxP系统17-19
• 1.4.1 Cre/loxp原理17-18
• 1.4.2 Cre-loxp应用18-19
• 1.5 展望19-21
• 第2章 AQP2及体细胞核移植转基因猪的研究进展21-27
• 2.1 肾脏中水通道蛋白以及机体水平衡21-22
• 2.2 抗利尿激素对肾AQP2的调节22
• 2.3 AQP2调节机制22-23
• 2.4 猪体细胞核移植23-26
• 2.4.1 表观重编程对体细胞核移植的影响24
• 2.4.2 受体细胞对体细胞核移植的影响24-25
• 2.4.3 供体细胞对体细胞核移植的影响25
• 2.4.4 环境因素对体细胞核移植的影响25
• 2.4.5 体细胞核移植的应用25-26
• 2.5 展望26-27
• 第二篇 研究内容27-79
• 第1章 AQP-Cre表达载体的构建及分析27-45
• 前言27-28
• 1.1 材料和方法28-30
• 1.1.1 实验材料28
• 1.1.2 相关仪器28
• 1.1.3 主要溶液及试剂的配制28-30
• 1.2 实验方法30-36
• 1.2.1 引物设计30-31
• 1.2.2 总RNA提取31
• 1.2.3 c DNA合成31-32
• 1.2.4 RT-PCR32
• 1.2.5 组织蛋白提取32-33
• 1.2.6 Western Blotting分析33
• 1.2.7 构建AQP2启动子序列驱动Cre重组酶表达的表达载体33-36
• 1.2.8 细胞培养及转染36
• 1.3 结果36-42
• 1.3.1 分析AQP2在中国小型实验猪组织的表达36-37
• 1.3.2 肾特异性AQP2-Cre表达载体的构建37-40
• 1.3.3 利用LLC-PK1细胞分析AQP2-Cre表达载体瞬时转染后的表达情况40-42
• 1.4 讨论42-44
• 1.5 小结44-45
• 第2章 表达AQP-Cre/loxp的转基因猪的制备45-63
• 前言45
• 2.1 材料和方法45-53
• 2.1.1 实验材料45-46
• 2.1.2 相关仪器46
• 2.1.3 主要溶液及试剂的配制46-47
• 2.1.4 实验方法47-49
• 2.1.5 AQP2-Cre转基因猪各组织中Cre表达模式49-51
• 2.1.6 组织蛋白提取51
• 2.1.7 Western Blotting分析51-52
• 2.1.8 AQP2-Cre转基因猪免疫组织化学分析52
• 2.1.9 数据统计52-53
• 2.2 结果53-60
• 2.2.1 供体细胞的筛选53-54
• 2.2.2 Cre-AQP2转基因猪的获得54-56
• 2.2.3 Cre-AQP2转基因猪的鉴定56-58
• 2.2.4 Western Blotting和免疫组化分析Cre蛋白在转基因猪中的表达位置58-60
• 2.3 讨论60-61
• 2.4 小结61-63
• 第3章 Cre重组酶在转基因猪中的鉴定63-79
• 前言63-64
• 3.1 材料和方法64-71
• 3.1.1 实验动物来源64
• 3.1.2 主要试剂64
• 3.1.3 相关仪器64
• 3.1.4 Cre重组酶功能分析64-65
• 3.1.5 qPCR分析转基因Cre的拷贝数65-67
• 3.1.6 hiTAIL-PCR对整合位点的分析67-71
• 3.1.7 数据分析71
• 3.2 结果71-75
• 3.2.1 Cre重组酶重组效率分析71-72
• 3.2.2 AQP2-Cre基因拷贝数鉴定72-74
• 3.2.3 AQP2-Cre整合位点分析74-75
• 3.3 讨论75-78
• 3.4 小结78-79
• 结论79-81
• 参考文献81-92
• 导师简介92-93
• 作者简介及在读期间取得的科研成果93-94
• 致谢94

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本文编号：430307