利用条件性敲除小鼠模型对mTOR在肌肉和脂肪发育中的功能研究

发布时间：2017-06-30 06:11

  本文关键词：利用条件性敲除小鼠模型对mTOR在肌肉和脂肪发育中的功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：在动物机体组成中,肌肉占动物体重的40%以上,是动物主要的运动和代谢器官。常见的肌肉生长发育异常包括:遗传缺陷引发的肌肉营养不良,年龄增长出现的肌肉减少症,缺乏锻炼引起的肌肉萎缩症,以及癌症导致的肌肉恶病质等。所有这些病症都严重影响人类的生活质量和动物的产肉性能。脂肪组织是机体能量的储存场所,脂肪组织大多以白色脂肪(white adipose tissue,WAT)和棕色脂肪(brown adipose tissue,BAT)的形式存在,近期在小鼠中发现还存在米色脂肪。体内过多的白色脂肪沉积会引发肥胖以及糖尿病,心脏病等疾病的发生,降低动物的生产性能。与白色脂肪不同的是,米色脂肪与棕色脂肪氧化代谢水平高,以产热的形式消耗大量能量,因而提高棕色脂肪和米色脂肪的沉积,降低白色脂肪的沉积成为解决肥胖相关疾病的关键。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mamlian target of rapamycin,m TOR)属于丝氨酸/苏氨酸激酶,参与蛋白表达,细胞增殖,细胞分化,能量代谢等多种生物过程的调控。通过敲除m TOR的结合蛋白Raptor或Rictor发现,小鼠会出现代谢紊乱,肌肉萎缩等症状;敲除Raptor的小鼠脂肪组织重量减小,脂肪代谢能力升高;而敲除Rictor的小鼠体重升高,但是脂肪组织的重量不变。以上结果接暗示m TOR对肌肉和脂肪生长发育和能量代谢有调控作用,然而在小鼠全身性敲除m TOR会导致小鼠胚胎期致死,限制了对m TOR的功能研究。随着转基因动物技术的发展和成熟,现在能够利用基因敲除技术,实现组织特异性和时间特异性敲除目的基因。在本研究中,采用Cre-Lox P系统建立了组织特异性m TOR敲除小鼠模型,研究m TOR在肌肉和脂肪组织生长发育中的功能,主要试验结果总结如下:1.敲除m TOR对肌肉干细胞行为和骨骼肌再生的影响通过Pax7-Cre ER小鼠介导,成功构建了骨骼肌卫星细胞特异性m TOR敲除小鼠模型。利用毒素诱导肌肉的损伤来模拟肌肉发育的过程,发现无论是敲除m TOR还是用雷帕霉素阻断m TOR信号通路,都会严重阻碍骨骼肌的再生过程,小鼠肌肉再生面积下降到对照组的50%左右(P0.05)。为了检测敲除m TOR是否通过调控卫星细胞抑制骨骼肌再生,体外分离培养了单根肌纤维,结果显示,敲除m TOR不仅降低了单根肌纤维上细胞团的数目,而且降低了单个细胞团中卫星细胞的数目;与此相一致的是,在体外培养的卫星细胞中,观察到敲除m TOR之后,Ki67(细胞增殖标志物)阳性细胞比例显著少于对照组(P0.01),细胞增殖相关基因TK和DHFR的表达量均显著低于对照组(P0.01)。通过对卫星细胞的分化能力检测,发现Myo G阳性细胞要少于对照组,因此m TOR敲除后细胞早期分化程度降低;在分化5天的m TOR敲除细胞中观察到仅有少量的肌球重链蛋白表达,并且形成的肌管很瘦小,对照组则有大量粗壮的肌管形成,肌球重链蛋白表达水平高,因而对照组细胞分化程度更高。以上结果表明,m TOR敲除不仅抑制骨骼肌卫星细胞的早期分化,而且抑制了终末分化。对卫星细胞的定向的检测结果显示,处于静息状态、增殖状态和分化状态的细胞所占比例在m TOR敲除细胞和对照组细胞中差异不显著,表明m TOR的缺失不影响卫星细胞的定向。敲除m TOR或者利用雷帕霉素阻断m TOR信号通路之后,卫星细胞Pax7,以及成肌调控因子Myf5,Myo D和Myo G的表达下调。因此m TOR可能是通过调节Pax7和成肌调控因子的表达来实现对骨骼及卫星细胞行为的调控,进而影响骨骼肌的再生。2.敲除m TOR对心脏正常功能和心肌细胞的影响利用Mck-Cre小鼠介导m TOR的敲除,发现敲除小鼠在出生后1个月内死亡,死亡原因是心脏疾病。分别在动物个体的心肌组织和细胞水平研究了m TOR缺失引发的小鼠心脏变化。m TOR敲除之后,m TORC1和m TORC2信号通路同时受阻,导致蛋白质的翻译水平下调,特别是抗肌萎缩蛋白(dystrophin)的下调,引发了心肌细胞受损和心肌细胞的凋亡,并且小鼠出现心脏呈现纤维化的症状和扩张性心肌病。心脏肌纤维类型也发生了转变,敲除小鼠的Myh6+心肌纤维被能量代谢水平更低的Myh7+心肌纤维所取代。与此相一致的是,m TOR敲除之后心肌组织的脂肪酸氧化代谢和糖酵解水平都显著下调,推测能量水平可能无法满足心脏的正常活动需要,引发心力衰竭。综合以上结果,本研究为扩张性心肌病的提供了动物模型,揭示了m TOR在心肌细胞存活以及心脏组织的正常结构和功能维持方面发挥着重要的作用。3.敲除m TOR对脂肪组织生长发育的影响采用Adiponectin-Cre小鼠介导,成功构建了脂肪组织特异性m TOR敲除小鼠模型。经过称量发现m TOR敲除降低小鼠的脂肪沉积,BAT、前端皮下白色脂肪(anterior subcutaneous white adipose tissue,as WAT)、腹股沟白色脂肪(inguinal white adipose tissue,ing WAT)和腹内白色脂肪(visceral white adipose tissue,v WAT)的平均重量都低于对照组的50%以上(P0.05)。HE染色结果显示,m TOR敲除小鼠中BAT和WAT的脂肪细胞小于对照组,并且ing WAT部分区域出现了类似棕色脂肪组织的多腔室的细胞形态。m TOR敲除小鼠中,BAT的标志性基因UCP1和Prdm16的表达量升高到对照组的2倍左右,显著高于对照组(P0.05),与脂肪组织形成相关的Pparγ升高到对照组的3倍,而C/EBPα的表达显著降低(P0.05);脂肪特异性的基因Adiponectin,Leptin,Pparγ和Srebp1c在m TOR敲除小鼠的白色脂肪中表达量都显著低于对照组,能量代谢相关基因,Ucp1,Pgc1α和Pparα的表达都显著升高,因此,在脂肪组织中m TOR敲除可能抑制了脂肪细胞的分化,提高了能量代谢水平。然而,米色脂肪相关的标志基因,Tbx1、CD137和Tmem26的表达没有发生显著的变化,因此可能没有米色脂肪的形成。在体外分离培养的BAT和WAT成脂细胞分化过程中发现,脂肪形成相关基因表达下调,m TOR敲除会抑制成脂细胞分化。在寒冷环境下,小鼠的体温主要是依赖于棕色脂肪组织的能量代谢来维持,虽然m TOR敲除小鼠的棕色脂肪组织变小,但是在低温环境中体温与对照组差异不显著,这可能是由于单位重量的脂肪代谢能力升高所致。通过代谢笼试验,观察到m TOR敲除小鼠和对照组小鼠的产热能力差异不显著,因此也支持单位重量的脂肪代谢能力升高的推测。高能量饲料诱导小鼠的肥胖的试验结果发现,高能饲料喂养小鼠12周之后,对照组小鼠的棕色脂肪重量约为m TOR敲除小鼠的3倍;差异最大的白色脂肪是腹内脂肪,对照组小鼠腹内白色脂肪比m TOR敲除小鼠高达6倍,对照组小鼠as WAT和ing WAT重量达到m TOR敲除小鼠的2倍。以上结果表明,m TOR在脂肪组中的敲除抑制成脂细胞的分化和脂肪的沉积,m TOR敲除之后脂肪组织代谢能力升高,可以抵抗高能饲料诱导的肥胖。
【关键词】：小鼠 mTOR 肌肉发育 脂肪发育 扩张性心肌病
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q954.48
【目录】：

• 摘要10-13
• ABSTRACT13-16
• 缩略词表16-17
• 第一章 文献综述17-33
• 1 前言17
• 2 肌肉生长发育的研究进展17-22
• 2.1 肌肉生长发育的过程17-18
• 2.2 肌肉干细胞18-19
• 2.3 肌肉损伤修复与再生19-20
• 2.4 肌肉损伤修复的调控20-22
• 3 脂肪生长发育研究进展22-26
• 3.1 脂肪的分类22-23
• 3.2 脂肪干细胞的来源23
• 3.3 脂肪的生长与发育调控23-26
• 4 mTOR信号通路研究进展26-29
• 4.1 mTOR信号通路及其功能26-27
• 4.2 mTOR对肌肉发育和再生的调控27-28
• 4.3 mTOR对脂肪生长发育的调控28-29
• 5 Cre-LoxP系统及其构建基因敲除动物的研究进展29-31
• 5.1 Cre-LoxP系统的研究进展29-30
• 5.2 骨骼肌特异性敲除小鼠模型的研究进展30-31
• 5.3 脂肪组织特异性敲除小鼠模型的研究进展31
• 6 研究目的与意义31-33
• 第二章 利用骨骼肌卫星细胞特异性敲除小鼠研究mTOR在肌肉再生和肌肉干细胞中的功能33-57
• 1 试验材料33-34
• 1.1 试验动物33
• 1.2 主要仪器和设备33-34
• 2 试验方法34-42
• 2.1 苏木素-伊红染色（Hematoxylin and eosin staining，H&E staining）34-35
• 2.1.1 试剂配制34
• 2.1.2 染色步骤34-35
• 2.2 骨骼肌卫星细胞的分离培养35-36
• 2.2.1 试剂配制35
• 2.2.2 骨骼肌卫星细胞分离培养35-36
• 2.2.3 骨骼肌卫星细胞的分化36
• 2.3 小鼠基因分型36-37
• 2.3.1 试剂配制36
• 2.3.2 试验步骤36-37
• 2.4 蛋白质提取与Western blot37-39
• 2.4.1 试剂配制37-39
• 2.4.2 试验步骤39
• 2.5 mRNA提取与定量PCR39-40
• 2.6 肌肉损伤和再生检测40
• 2.7 Tamoxifen诱导基因敲除40
• 2.8 Evansblue染色40
• 2.9 免疫荧光染色40-41
• 2.9.1 试剂配制40-41
• 2.9.2 染色步骤41
• 2.10 单根肌纤维分离培养41-42
• 2.10.1 试剂配制41
• 2.10.2 单根肌纤维分离培养41-42
• 3 结果与分析42-53
• 3.1 骨骼肌卫星细胞特异性mTOR敲除小鼠模型的构建42
• 3.2 骨骼肌卫星细胞特异性mTOR敲除小鼠模型的鉴定42-43
• 3.3 敲除mTOR对骨骼肌再生的影响43-45
• 3.4 药物阻断mTOR信号通路对肌肉损伤修复的影响45-47
• 3.5 敲除mTOR对单根肌纤维上骨骼肌卫星细胞的数目的影响47-49
• 3.6 mTOR敲除对卫星细胞定向的影响49-50
• 3.7 mTOR敲除对细胞分化的影响50-51
• 3.8 mTOR敲除对成肌因子表达的影响51-53
• 4 讨论53-57
• 4.1 骨骼肌特异性mTOR敲除小鼠模型的建立53
• 4.2 敲除mTOR对肌肉再生的影响53-54
• 4.3 mTOR不影响骨骼肌卫星细胞的定向54
• 4.4 敲除mTOR抑制骨骼肌卫星细胞的增殖和分化54-56
• 4.5 mTOR调控骨骼肌卫星细胞行为的作用机制56-57
• 第三章 mTOR在心肌发育中的功能57-70
• 1 试验动物57
• 2 试验方法57-58
• 2.1 马松三色法染色（Masson's Trichrome Staining）57-58
• 2.1.1 试剂配制57
• 2.1.2 染色步骤57-58
• 3 试验结果58-67
• 3.1 Mck-Cre介导的mTOR敲除小鼠的构建及鉴定58-59
• 3.2 mTOR敲除小鼠的表型特征59-60
• 3.3 心肌mTOR缺失引发扩张性心肌病60-63
• 3.4 心肌mTOR缺失对心肌细胞的影响63-64
• 3.5 心肌细胞死亡导致心脏纤维化64-66
• 3.6 心肌mTOR对心脏能量代谢的影响66-67
• 3.7 mTOR缺失对下游信号通路的影响67
• 4 讨论67-70
• 第四章 mTOR在脂肪发育中的功能70-88
• 1 试验材料70
• 1.1 试验动物70
• 1.2 主要仪器和设备70
• 2 试验方法70-73
• 2.1 葡萄糖耐受性检测70-71
• 2.2 胰岛素敏感性检测71
• 2.3 脂肪组织血管基质部分细胞的分离培养71-72
• 2.3.1 试剂配制71-72
• 2.3.2 脂肪组织血管基质部分细胞的分离培养72
• 2.4 油红O染色72-73
• 2.4.1 试剂配制72-73
• 2.4.2 试验步骤73
• 2.5 代谢笼试验73
• 3 结果与分析73-84
• 3.1 脂肪组织特异性mTOR敲除小鼠模型的构建73-74
• 3.2 脂肪组织特异性mTOR敲除小鼠的鉴定74-75
• 3.3 敲除mTOR对脂肪沉积的影响75-77
• 3.4 mTOR敲除对脂肪细胞的影响77
• 3.5 mTOR对脂肪形成相关基因表达的调控77-79
• 3.6 SVF细胞的成脂肪分化需要mTOR的参与79-80
• 3.7 mTOR对低温下小鼠体温维持的影响80-81
• 3.8 mTOR敲除对小鼠的能量代谢的调控81-82
• 3.9 小鼠mTOR敲除对高能饲料诱导下脂肪沉积的影响82-83
• 3.10 mTOR敲除小鼠的胰岛素敏感性分析83-84
• 4 讨论84-88
• 4.1 脂肪特异性mTOR敲除小鼠模型的构建84-85
• 4.2 mTOR对脂肪沉积的调控85-86
• 4.3 成脂肪细胞的分化需要mTOR的参与86
• 4.4 mTOR敲除之后增加了脂肪的能量消耗86-87
• 4.5 小鼠敲除mTOR之后可以抵制高能饲料诱导的肥胖87-88
• 第五章 结语88-90
• 1 主要结论88
• 2 本研究的创新点88-89
• 3 值得一步研究解决的问题89-90
• 参考文献90-105
• 致谢105-107
• 博士在读期间发表论文107-109

【共引文献】

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本文编号：500845