玛氏骨条藻在不同环境条件下的转录组和表达谱特征分析

发布时间：2017-07-03 08:16

  本文关键词：玛氏骨条藻在不同环境条件下的转录组和表达谱特征分析

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【摘要】：赤潮是一种异常生态现象,赤潮的发生对于海洋生态环境、渔业生产、旅游业乃至人类身体健康都会产生严重的影响。最近一二十年来,赤潮发生的频率不断增加,范围不断加大,产生的危害也不断加剧,因此,赤潮已成为全球海洋科学研究的热点之一。有关赤潮的研究已经取得了大量的成果,但是作为一种重要的赤潮藻,目前对玛氏骨条藻的研究仍然比较有限,尤其是缺乏基因组信息,对其爆发和消亡的分子机制缺乏系统深入的研究。本研究利用Illumina高通量测序技术对玛氏骨条藻不同生长期(指数期、稳定期、衰亡期)和低温胁迫、高温胁迫、低硅胁迫条件下的转录组进行了测序,并开展了数字基因表达谱(DGE)特征分析。通过全面、系统地了解玛氏骨条藻转录组特征,探索不同生长期的表达谱差异,深入分析玛氏骨条藻响应低温、高温和低硅环境胁迫的分子机制,为研究玛氏骨条藻赤潮爆发的分子机制提供新认识。主要研究内容和结果如下：(1)利用Illumina高通量测序技术对不同生长时期和不同胁迫处理的玛氏骨条藻混合RNA样品进行转录组测序,共获得117,184,612条干净的短读长序列(clean reads),碱基总量约为11.7G,拼接后得到20,319条平均长度为1,602bp的非重复序列基因(unigenes)。通过筛查序列中可能存在的分子标记,发现了3,220个潜在的简单重复序列(SSR)位点、171,260个单核苷酸多态性(SNP)位点以及9,464个插入缺失(InDel)多态性位点。通过与NR、NT、SwissProt、GO、 KOG、PFAM、KO等多种数据库进行比对注释,发现玛氏骨条藻转录组中包含大量响应营养盐缺乏、温度胁迫、光胁迫等逆境胁迫以及抗氧化系统等相关功能基因,也发现许多发育过程相关功能基因。通过KEGG代谢途径分析,发现了玛氏骨条藻中包含225条代谢途径,其中包括与细胞生长和衰亡相关的细胞周期途径、细胞凋亡途径,参与运输和分解代谢的内吞作用途径,参与细胞信号转导的MAPK信号通路、钙离子信使通路、植物激素信号转导通路,参与蛋白质折叠、分选和降解的泛素介导的蛋白质水解通路,以及糖酵解／糖异生代谢通路、丙酮酸盐代谢通路、脂肪酸生物合成与代谢通路、不饱和脂肪酸生物合成通路等。(2)为了研究不同生长期的表达谱特征,将玛氏骨条藻指数期、稳定期和衰亡期三个生长时期的9个样品分别建库和Illumina测序(每个处理组设置三个生物学重复),每个处理组样品获得7.74M-12.86M干净的短读长序列,且与玛氏骨条藻转录组可比对(map)上的短读长序列数占短读长序列总数的92.16%-94.55%。三个时期基因差异表达分析表明,1544个基因在玛氏骨条藻生长稳定期与指数期细胞中存在显著差异表达,衰亡期和指数期之间差异表达基因个数为2706个,而稳定期与衰亡期差异表达基因个数仅有95个,表明两个生长期之间基因表达模式比较相似。通过GO富集和KEGG富集分析,这些差异表达的基因涉及到多个生物学功能的调控,例如能量代谢、脂肪酸合成与代谢、细胞骨架与微管运动、细胞周期、细胞凋亡等。研究还发现,玛氏骨条藻微管与细胞骨架相关基因的转录活力从指数期到衰亡期持续下调。(3)为了研究玛氏骨条藻响应温度胁迫环境的表达谱特征,将玛氏骨条藻在低温胁迫、高温胁迫、常温培养的样品分别建库和Illumina测序,每个处理组样品获得10.60M-14.46M干净的短读长序列,且与玛氏骨条藻转录组可比对(map)上的短读长序列数占短读长序列总数的92.16%-93.84%。对玛氏骨条藻低温胁迫和常温对照两个表达谱数据库进行统计分析,发现出现表达差异的unigene共有1178条,其中有659条基因在低温胁迫下表达丰度上调,519条基因在低温胁迫下表达丰度下调。在高温胁迫处理的样品中,发现表达差异的基因共有247条,其中上调表达的基因128个,下调表达的基因119个。低温胁迫处理样品中,GO功能显著富集的基因主要涉及核糖体结构组分、大分子生物合成、结构分子活性、细胞组分生物合成、光合作用、碳利用等,KEGG代谢通路显著富集的基因主要涉及卟啉和叶绿素代谢、脂肪酸合成与代谢、生物素代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢。高温胁迫处理样品中,GO功能显著富集的基因主要涉及细胞壁结构组分、未折叠蛋白结合、植物细胞壁生物合成,KEGG代谢通路显著富集的基因主要涉及细胞凋亡、内质网蛋白质加工、MAPK信号通路、氨基酰tRNA生物合成等代谢通路。(4)为了研究玛氏骨条藻响应低硅胁迫环境的表达谱特征,将玛氏骨条藻在低硅胁迫、对照组培养的样品分别建库和Illumina测序,每个处理组样品获得9.60M-12.14M干净的短读长序列,且与玛氏骨条藻转录组可比对(map)上的短读长序列数占短读长序列总数的92.16%-93.69%。在低硅胁迫处理的样品中,发现表达差异的基因共有258条,其中上调表达的基因62个,下调表达的基因196个。低硅胁迫处理样品中,GO功能富集的基因主要涉及乙醇代谢过程、硅酸盐转运蛋白、微管、光合作用、糖异生、糖酵解等,KEGG代谢通路富集的基因主要涉及丙酮酸盐代谢、糖酵解、糖异生、柠檬酸循环、磷酸戊糖途径等代谢通路。
【关键词】：玛氏骨条藻 转录组 表达谱 生长期 胁迫 差异表达基因
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 摘要5-8
• Abstract8-16
• 第一章 文献综述16-37
• 1.1 海洋浮游植物与赤潮16-22
• 1.1.1 海洋浮游植物16
• 1.1.2 赤潮16-20
• 1.1.3 玛氏骨条藻—一种重要的赤潮藻20-22
• 1.2 转录组学概述22-31
• 1.2.1 测序技术的发展22-28
• 1.2.2 转录组和转录组学概念28-29
• 1.2.3 转录组学研究方法29-31
• 1.3 藻类基因组学研究进展31-36
• 1.3.1 藻类基因组研究进展31-33
• 1.3.2 藻类转录组研究进展33-36
• 1.4 本研究的目的和意义36-37
• 第二章 玛氏骨条藻转录组测序及分析37-89
• 2.1 材料37-39
• 2.1.1 藻种37
• 2.1.2 f/2培养基37-38
• 2.1.3 主要试剂、仪器及耗材38-39
• 2.1.4 玛氏骨条藻的培养39
• 2.2 方法39-45
• 2.2.1 玛氏骨条藻细胞的收集39-40
• 2.2.2 总RNA提取及质量检测40-41
• 2.2.3 文库的构建及测序41-42
• 2.2.4 测序数据的分析42-45
• 2.3 结果与分析45-87
• 2.3.1 实验样品RNA制备的质量检测45-46
• 2.3.2 测序数据质量情况汇总和转录本的拼接46-51
• 2.3.3 基因注释51-66
• 2.3.4 玛氏骨条藻生长、繁殖、响应逆境胁迫相关基因66-68
• 2.3.5 MAPK信号途径相关基因68-70
• 2.3.6 内吞作用途径相关基因70-72
• 2.3.7 细胞凋亡途径相关基因72-74
• 2.3.8 细胞周期途径相关基因74-79
• 2.3.9 泛素介导的蛋白质水解作用途径相关基因79-82
• 2.3.10 SNP和SSR的筛选82-87
• 2.4 讨论与小结87-89
• 第三章 玛氏骨条藻不同生长期表达谱(DGE)特征分析89-136
• 3.1 材料89-90
• 3.1.1 藻种89
• 3.1.2 f/2培养基89
• 3.1.3 主要试剂、仪器及耗材89
• 3.1.4 玛氏骨条藻的培养89-90
• 3.2 方法90-93
• 3.2.1 玛氏骨条藻细胞的收集90
• 3.2.2 总RNA提取及质量检测90
• 3.2.3 文库的构建及测序90
• 3.2.4 测序数据的分析90-93
• 3.3 结果与分析93-134
• 3.3.1 实验样品RNA制备的质量检测93-94
• 3.3.2 测序数据的产出和质量评估94-97
• 3.3.3 基因表达水平分析97-100
• 3.3.4 实验重复相关性检测100-101
• 3.3.5 不同生长时期表达谱差异表达基因的筛选及分析101-104
• 3.3.6 不同生长期表达谱之间的差异表达基因聚类分析104-105
• 3.3.7 不同生长时期表达谱差异表达基因的GO注释分析105-116
• 3.3.8 不同生长时期表达谱差异表达基因的GO富集层次分析116-123
• 3.3.9 不同生长时期表达谱差异表达基因的KEGG Pathway注释分析123-134
• 3.4 讨论与小结134-136
• 第四章 玛氏骨条藻温度应答表达谱(DGE)特征分析136-176
• 4.1 材料136-137
• 4.1.1 样品来源136
• 4.1.2 f/2培养基136
• 4.1.3 主要试剂、仪器及耗材136
• 4.1.4 玛氏骨条藻的培养136-137
• 4.2 方法137-138
• 4.2.1 玛氏骨条藻细胞的收集137
• 4.2.2 总RNA提取及质量检测137
• 4.2.3 文库的构建及测序137
• 4.2.4 测序数据的分析137-138
• 4.3 结果138-174
• 4.3.1 实验样品RNA制备的质量检测138-140
• 4.3.2 测序数据的产出和质量评估140-143
• 4.3.3 基因表达水平分析143-145
• 4.3.4 实验重复相关性检测145
• 4.3.5 不同温度应答表达谱差异表达基因的筛选及分析145-149
• 4.3.6 不同温度应答表达谱的差异表达基因聚类分析149-150
• 4.3.7 不同温度应答表达谱差异表达基因的GO注释分析150-159
• 4.3.8 不同温度应答表达谱差异表达基因的GO富集层次分析159-165
• 4.3.9 不同温度应答表达谱差异表达基因的KEGG Pathway注释分析165-174
• 4.4 讨论与小结174-176
• 第五章 玛氏骨条藻低硅应答表达谱(DGE)特征分析176-201
• 5.1 材料176-177
• 5.1.1 样品来源176
• 5.1.2 f/2培养基176
• 5.1.3 主要试剂、仪器及耗材176
• 5.1.4 玛氏骨条藻的培养176-177
• 5.2 方法177-178
• 5.2.1 玛氏骨条藻细胞的收集177
• 5.2.2 总RNA提取及质量检测177
• 5.2.3 文库的构建及测序177
• 5.2.4 测序数据的分析177-178
• 5.3 结果178-199
• 5.3.1 实验样品RNA制备的质量检测178-179
• 5.3.2 测序数据的产出和质量评估179-181
• 5.3.3 基因表达水平分析181-183
• 5.3.4 实验重复相关性检测183-184
• 5.3.5 表达谱差异表达基因的筛选及分析184-185
• 5.3.6 低硅应答和对照组表达谱之间的差异表达基因聚类分析185-186
• 5.3.7 低硅应答表达谱差异表达基因的GO注释分析186-192
• 5.3.8 低硅应答表达谱差异表达基因的KEGG Pathway注释分析192-199
• 5.4 讨论与小结199-201
• 第六章 总结201-203
• 参考文献203-214
• 作者简介214-215
• 致谢215-216

  本文关键词：玛氏骨条藻在不同环境条件下的转录组和表达谱特征分析

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