白腐真菌漆酶及同工酶基因家族的克隆表达调控研究

发布时间：2017-07-05 05:18

  本文关键词：白腐真菌漆酶及同工酶基因家族的克隆表达调控研究

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【摘要】：漆酶(p-diphenol:oxygen oxidoreductase; EC1.10.3.2)是一类含铜多酚氧化酶,其广泛分布于高等植物及真菌中,是白腐真菌特异胞外降解酶系中的重要组分。白腐真菌漆酶与木质素降解、酚类物质的氧化、色素合成、孢子形成以及子实体分化等多种功能有着密切联系。由于漆酶有着广泛的底物作用范围及重要的生物降解功能,其在造纸工业、生物燃料、食品加工、染料脱色、工业废水处理等领域有着巨大的应用潜力和开发价值。因此,开展漆酶基因资源的获取、表达调控等方面的研究对于丰富漆酶基因资源及解析漆酶基因家族及功能,促进漆酶高效表达具有重要的理论意义及应用价值。本论文以白腐真菌漆酶为核心,进行了漆酶基因的克隆、异源表达、重组漆酶的特性以及漆酶基因家族的表达调控等一系列的研究,具体研究结果如下： 以白腐真菌Ganoderma sp. En3, Pleurotus ostreatus BP2为出发菌株,利用简并引物PCR、TAIL-PCR、RT-PCR、SEFA-PCR、保守引物PCR技术,从菌株En3中克隆得到一条漆酶结构基因lac-En3-1及其全长cDNA序列；从菌株BP2中得到了漆酶基因家族11条不同漆酶同工酶的cDNA序列及相应漆酶基因上游调控序列。对相应漆酶基因调控序列进行生物信息学分析,结果表明漆酶基因上游序列中存在多个顺式作用调控元件如金属响应元件MRE、异生物质响应元件XRE、CreA结合位点、NIT2结合位点等。 将来源自Ganoderma sp. En3的漆酶基因lac-En3-1进行了毕赤酵母异源表达,得到了具有漆酶活力的酵母转化子,验证了其漆酶功能。对重组漆酶蛋白rLAC-En3-1进行了分离纯化并研究了其酶学特性,发现rLAC-En3-1在pH大于7的碱性环境中具有较高的稳定性,同时对一些酶类抑制剂如SDS、EDTA,及工业中常用的金属离子和有机溶剂等有较好的耐受性,并在染料降解及脱毒方面显示出良好效果。 通过分别添加不同类型的诱导物如金属离子,芳香化合物,金属离子和芳香化合物的组合及醇类等,研究了白腐真菌Pleurotus ostreatus BP2漆酶基因家族不同漆酶同工酶基因的转录调控情况,结果显示：铜离子显著促进Pleurotus ostreatus BP2漆酶同工酶所有基因转录水平上调,而铁、锰、铬等其它金属离子则对部分漆酶基因转录水平上调显示出诱导作用。发现了显著诱导Pleurotus ostreatus BP2基因家族转录水平上调的7种芳香化合物,不同芳香化合物的诱导作用存在差异。金属离子和芳香化合物的组合诱导对Pleurotus ostreatus BP2部分漆酶基因有明显协同效果。在醇类诱导及其它条件下Pleurotus ostreatus BP2漆酶基因转录水平也有所上调。 进一步通过Time Course实验研究了若干种芳香族化合物对于Pleurotus ostreatus BP2漆酶同工酶基因转录的影响,发现肉桂酸、3,4,5-三甲氧基肉桂酸、3,4-二甲氧基肉桂酸、香豆酸、阿魏酸、香草酸在第8天对Pleurotus ostreatus BP2漆酶基因的转录诱导效果明显,4-甲氧基肉桂酸、3-羟基-4甲氧基肉桂酸在第10天对Pleurotus ostreatus BP2漆酶基因转录水平的诱导效果明显。 综上所述,本论文从Ganoderma sp.En3中克隆得到一条漆酶基因lac-En3-1,从Pleurotus ostreatus BP2中克隆得到了11条不同漆酶同工酶基因cDNA及其上游调控区域。将lac-En3-1漆酶编码基因进行了毕赤酵母异源表达,纯化得到的重组漆酶rLAC-En3-1具有较好的有机溶剂、金属离子耐受性以及合成染料脱毒脱色能力。研究了不同诱导条件下Pleurotus ostreatus BP2漆酶基因家族转录水平的调控情况,发现多种金属离子、芳香化合物、醇类等对于漆酶基因家族的转录具有诱导上调作用。
【关键词】：白腐真菌 漆酶基因 漆酶基因家族 异源表达 重组漆酶 表达调控
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q936
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 1 绪论10-33
• 1.1 白腐真菌及其木质素降解酶系10-13
• 1.2 漆酶的分布及本研究漆酶来源13-14
• 1.3 白腐真菌漆酶的结构14-15
• 1.4 白腐真菌漆酶的特性15-17
• 1.5 白腐真菌漆酶的催化反应机制与介体系统17-18
• 1.6 漆酶的应用18-20
• 1.7 漆酶的分子生物学研究进展20-27
• 1.8 漆酶同工酶的研究27-30
• 1.9 本论文研究思路,技术路线和主要研究内容30-33
• 2 白腐真菌Ganoderma sp.En3和Pleurotus ostreatus BP2的漆酶基因及其上游调控序列的克隆与分析33-75
• 2.1 引言33
• 2.2 材料和方法33-46
• 2.3 结果与讨论46-74
• 2.4 本章小结74-75
• 3 白腐真菌Ganoderma sp.En3漆酶基因在毕赤酵母中的异源表达及重组漆酶的性质和染料脱色降解研究75-102
• 3.1 引言75-76
• 3.2 材料和方法76-85
• 3.3 结果与讨论85-101
• 3.4 本章小结101-102
• 4 不同诱导物对白腐真菌Pleurotus ostreatus BP2漆酶基因家族不同漆酶同工酶基因的转录调控研究102-143
• 4.1 引言102
• 4.2 材料与方法102-106
• 4.3 结果与讨论106-142
• 4.4 本章小结142-143
• 5 芳香化合物诱导Pleurotus ostreatus BP2漆酶基因家族转录的TimeCourse分析143-157
• 5.1 引言143
• 5.2 材料和方法143-145
• 5.3 结果与讨论145-156
• 5.4 本章小结156-157
• 6 全文总结157-160
• 6.1 主要结论157-158
• 6.2 创新性158-159
• 6.3 展望159-160
• 致谢160-163
• 参考文献163-183
• 附录1 攻读博士学位期间发表论文183-184
• 附录2 本文涉及的基因序列信息184-197

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本文编号：520651