人源PHF6 extended PHD2结构域以及PHF6与RBBP4相互作用的结构与功能研究

发布时间：2017-08-10 06:05

  本文关键词：人源PHF6 extended PHD2结构域以及PHF6与RBBP4相互作用的结构与功能研究

  更多相关文章： PHF6 BFLS疾病 extended PHD T-ALL NuRD复合物 RBBP4 转录抑制

【摘要】：人源PHF6(PHD finger protein6)基因,位于X染色体q26-q27区,是目前己知的唯一发现与Borjeson-Forssman-Lehmann Syndrome (BFLS)遗传疾病相关的基因。另外PHF6基因还被发现在急性T淋巴细胞白血病病人或急性髓细胞白血病病人中存在多种形式的突变,使得PHF6蛋白丧失活性。PHF6蛋白被发现与PAF1复合物关联并调控大脑皮层神经元的迁移,这可能与人的智力形成有关。PHF6蛋白还被发现在细胞核质中与NuRD复合物相互作用,但具体功能并不清楚。另有研究表明PHF6蛋白在核仁中通过与UBF1相互作用调控细胞周期和rRNA的合成。PHF6在生物体发育过程中起着非常重要的作用,与人的智力障碍疾病以及血液疾病等相关,但目前对PHF6蛋白的具体细胞功能和致病机理研究较少,结构方面研究没有报道。 PHF6蛋白含有两个不标准的PHD (plant homeodomain)结构域和四个核定位信号(NLS)。我们利用晶体学方法成功解析了PHF6的第二个extended PHD结构域(ePHD2),这是第一次该类型结构域的结构报道,该结构域比以前报道的PHD结构域在N端延伸了将近七十个氨基酸(称为：pre-PHD),该extended PHD2结构域同时螯合三个锌原子。Pre-PHD与PHD结构域间由一段长α螺旋和一段长的loop连接,它们存在广泛的相互作用,共同折叠成一个整体。我们用核磁弛豫实验研究了该结构域的动力学特征,并用RDC实验证明pre-PHD和PHD2是一个整体。PHD结构域一般识别组蛋白尾巴,不幸地是我们没有找到PHF6的extended PHD2结合组蛋白的有力证据,而我们通过凝胶迁移,荧光偏振和核磁滴定实验发现extended PHD2能够结合双链DNA,但没有序列特异性。另外我们发现PHF6蛋白能通过其包含核仁定位信号序列的区域与NuRD复合物的RBBP4/RbAp48组分直接相互作用,通过该相互作用PHF6蛋白能介导基因的转录抑制。 我们接着在前期工作的基础上利用ITC实验测量了PHF6小肽与RBBP4蛋白间的解离常数,并解析了二者的高分辨率复合物晶体结构。结构显示PHF6小肽结合在RBBP4偏小上表面的酸性裂缝中,PHF6小肽的一对碱性氨基酸的侧链插入到RBBP4的负电口袋中,而这对碱性氨基酸对PHF6与RBBP4间的相互作用的重要性用体外ITC实验和体内免疫共沉淀实验都得到证明。结构比较发现RBBP4结合PHF6小肽的口袋与其识别FOGl小肽和组蛋白H3的位置是一致的,但与其识别组蛋白H4, Su(z)12和MTA1小肽是分离的、不同的,说明RBBP4能够作为一个支架蛋白,通过自身结构的不同位置结合不同的蛋白,从而行使相关的功能。PHF6中的RBBP4识别motif在陆生脊椎动物中是高度保守的。我们发现PHF6的中间无序结构区域(145-207aa)就足以介导GAL4报告基因的转录抑制,而敲低RBBP4基因能够削弱PHF6蛋白介导的转录抑制。我们的研究在结构水平上确定了PHF6与NuRD复合物间的直接关联,也暗示PHF6在染色质结构调节和基因调控方面起着一定的作用,但其具体的生物学功能和调控机制还需要进一步研究和探索。
【关键词】：PHF6 BFLS疾病 extended PHD T-ALL NuRD复合物 RBBP4 转录抑制
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R394
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-13
• 第1章 绪论13-29
• 1.1 研究背景13-29
• 1.1.1 PHF6与Borjeson-Forssman-Lehmann综合征(BFLS)疾病,T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)和急性髓细胞白血病(AML)13-19
• 1.1.1.1 PHF6与Borjeson-Forssman-Lehmann综合征疾病13-18
• 1.1.1.2 PHF6与急性白血病18-19
• 1.1.2 Mi-2/NuRD(Nucleosome Remodeling and Deacetylation)复合物19-26
• 1.1.3 PHF6与Mi-2/NuRD复合物的相互作用26-28
• 1.1.4 PHF6与核糖体RNA(rRNA)的生物合成28-29
• 第2章 实验材料与方法29-65
• 2.1 人源PHF6和RBBP4/RbAp48的克隆29-45
• 2.1.1 蛋白质边界选择29
• 2.1.2 目的蛋白基因的扩增29-31
• 2.1.3 目的基因片段核酸电泳31-32
• 2.1.4 目的基因片段的胶回收32-33
• 2.1.5 质粒DNA的抽提33-34
• 2.1.6 基因片段、载体质粒的双酶切与回收34-36
• 2.1.7 酶切片段与载体连接36
• 2.1.8 大肠杆菌感受态细胞的制备36-37
• 2.1.9 连接产物或质粒转化大肠杆菌感受态细胞37-38
• 2.1.10 菌落PCR鉴定与测序38-39
• 2.1.11 突变体的构建39-40
• 2.1.12 RBBP4重组Bacmid的构建40-41
• 2.1.13 RBBP4重组Bacmid的鉴定与提取41-42
• 2.1.14 High Five~(TM)昆虫细胞(BT1-Tn-581-4 Insect cells)的复苏培养和冻存42-43
• 2.1.15 重组杆状病毒的获得43-45
• 2.2 PHF6和RBBP4/RbAp48蛋白的表达与粗纯化45-48
• 2.2.1 PHF6蛋白的表达与粗纯化45-47
• 2.2.2 RBBP4/RbAp48蛋白的表达与粗纯化47-48
• 2.3 SDS-PAGE电泳48-50
• 2.4 分子筛与离子交换50-51
• 2.5 蛋白质浓度的测定51
• 2.6 相互作用实验51-55
• 2.6.1 GST pull down实验51-52
• 2.6.2 凝胶迁移实验(EMSA)52-53
• 2.6.3 荧光偏振实验(FPA)53-54
• 2.6.4 Western blotting54-55
• 2.6.5 ITC实验55
• 2.7 核磁实验55-60
• 2.7.1 同位素标记PHF6 ePHD2结构域56
• 2.7.2 标记样品记核磁谱56
• 2.7.3 标记样品的冻干重溶56
• 2.7.4 核磁谱图处理与化学位移指认56-58
• 2.7.5 核磁共振约束指认(NOE和二面角约束)58
• 2.7.6 主链弛豫常数的测定58-59
• 2.7.7 RDC定向介质的制备59-60
• 2.8 蛋白结晶,数据收集与结构解析60-61
• 2.8.1 蛋白质的结晶60
• 2.8.2 晶体衍射数据收集、处理与结构解析60-61
• 2.9 哺乳细胞的培养与转染61-62
• 2.10 免疫共沉淀(co-IP)62-63
• 2.11 shRNA敲低(knockdown)基因63-65
• 第3章 PHF6蛋白extended PHD2结构域的结构功能研究65-93
• 3.1 实验结果65-87
• 3.1.1 PHF6蛋白extended PHD结构域边界的选择65
• 3.1.2 PHF6蛋白的克隆,表达,纯化65-71
• 3.1.3 PHF6 ePHD2结构域的主链动力学分析71
• 3.1.4 PHF6 extended PHD2结构域与组蛋白的相互作用71-72
• 3.1.5 PHF6 extended PHD2结构域的晶体生长,数据收集与结构解析72-75
• 3.1.6 PHF6 extended PHD2结构域的晶体结构75
• 3.1.7 PHF6 extended PHD2结构域折叠成一个整体75-77
• 3.1.8 PHF6 extended PHD2结构域代表一种新的结构模块77-79
• 3.1.9 PHF6 extended PHD2结构域非特异性结合双链DNA79-84
• 3.1.10 PHF6 extended PHD2结构域中的病理性点突变84-86
• 3.1.11 PHF6与NuRD复合物组分RBBP4直接相互作用86-87
• 3.1.12 PHF6介导的转录抑制依赖于其与RBBP4的相互作用87
• 3.2 讨论87-90
• 3.2.1 PHF6的extended PHD结构域代表一种新的结构模块87-89
• 3.2.2 BFLS,AML,T-ALL疾病中PHF6突变的影响89
• 3.2.3 PHF6与NuRD复合物组分RBBP4的直接相互作用对PHF6功能的提示89-90
• 3.3 总结90-93
• 第4章 PHF6与RBBP4相互作用的结构与功能研究93-107
• 4.1 实验结果93-103
• 4.1.1 重组RBBP4/RbAp48蛋白的表达与纯化93-94
• 4.1.2 RBBP4与PHF6(157-171 aa)小肽的等温滴定量热(ITC)实验94-95
• 4.1.3 RBBP4与PHF6小肽复合物晶体的获得与结构解析95-97
• 4.1.4 RBBP4与PHF6小肽间的相互作用细节97-98
• 4.1.5 PHF6的突变对RBBP4识别的影响98-100
• 4.1.6 RBBP4-PHF6复合物与其他RBBP4/RbAp46复合物的结构比较100-102
• 4.1.7 PHF6的中间无序区域足以介导转录抑制,且是RBBP4中等程度依赖的102-103
• 4.2 讨论103-105
• 4.2.1 PHF6-RBBP4间的相互作用是高度保守的104
• 4.2.2 PHF6,FOG1和组蛋白H3与RBBP4的相互作用是相互排斥的104-105
• 4.2.3 PHF6的突变可能影响受NuRD复合物调控的发育相关通路105
• 4.3 总结105-107
• 参考文献107-113
• 附录1113-114
• 附录2114-115
• 附录3115-159
• 致谢159-161
• 在读期间发表的学术论文与取得的研究成果161

【共引文献】

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本文编号：649148