年龄因素对人脂肪间充质干细胞生物学特性的影响
发布时间：2017-08-14 07:29
本文关键词：年龄因素对人脂肪间充质干细胞生物学特性的影响
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【摘要】：研究背景脂肪间充质干细胞(Adipose Derived Stem Cells, ADSCs)是从脂肪组织中提取的一种具有高度自我更新和多向分化潜能的多能干细胞,可以参与多种组织器官的再生修复,因其来源充足,取材方便等优势,具有良好的临床应用前景。目前,自体ADSCs已在临床用于软组织缺损修复,其在治疗心肌缺血和神经退行性病变的应用也进入了临床试验阶段。ADSCs的生物学特性是影响干细胞治疗成败的关键因素之一。随年龄增加,细胞发生自然老化,而且已有研究证实年龄因素会影响机体多种干细胞的生物学功能。那么,ADSCs是否随供者年龄增加而发生老化,从而导致其增殖、分化、迁移等生物学特性改变而最终影响修复功能还缺乏深入研究。研究目的明确不同年龄段人脂肪组织中间充质干细胞含量和老化程度的差异,及其表现在增殖、分化、迁移等生物学特性上的改变,为深入了解年龄因素对干细胞特性的影响及机制提供更丰富的信息,为不同年龄人群自体ADSCs的临床应用提供有效参考。研究内容及方法从临床获取24例人右肋缘皮下切取脂肪组织,按供者年龄分布情况,分为三组：(A)儿童组,年龄跨度6-12岁；(B)青年组,年龄跨度22-27岁；(C)老年组,年龄跨度60-73岁。通过酶消化法获得hADSCs,扩增至第三代(P3)用于实验检测。采用One-way ANOVA 及 Tuke y检验对实验结果进行多组定量资料的两两比较分析。具体研究内容包括：1.单位体积脂肪SVF含量及hADSCs纯度检测胶原酶消化法获得脂肪组织中有核细胞作为基质血管成分(Stromal Vascular Fraction, SVF),比较三组单位体积脂肪中的SVF含量差别；SVF贴壁培养获得hADSCs,流式分析P3代hADSCs干细胞表面标志物表达情况,比较三组符合干细胞表面标志表达要求的hADSCs比例。2.细胞老化程度及相关机制检测通过SA-β-Gal染色对各年龄组P5代lADSCs老化程度进行评价；利用MitoSOXTM荧光染色检测活细胞线粒体超氧化物含量；采用流式分析法检测hADSCs过氧亚硝酸含量；利用Real-time PCR检测]hADSCs端粒酶逆转录酶hTERT、组蛋白去乙酰化酶SIRT1表达水平,探索不同年龄组：hADSCs出现老化程度差异的机制。3.细胞增殖及凋亡检测MTS法检测各年龄组hADSCs增殖能力,并通过细胞周期分析及周期调控基因检测探索其机制；利用Muse细胞状态分析仪对细胞凋亡状态进行检测。4.细胞成脂成骨分化能力检测P3代hADSCs分别成脂成骨诱导培养,在不同时间点通过组化染色及Real-timePCR检测成脂成骨分化关键表型标志基因表达,明确不同年龄组hADSCs的多向分化能力的差异。5.细胞迁移能力及其机制检测利用划线法检测无外源因子作用时hADSCs迁移能力；利用Transwell法检测趋化因子作用下hADSCs的迁移能力。比较各年龄组hADSCs迁移能力的差异,并通过检测各年龄组hADSCs趋化因子受体CXCR4和CXCR7的表达水平探讨其机制。研究结果1.各年龄组单位体积脂肪SVF含量分别为：A组7.28×105±5.52×104个/ml、B组6.32×105±4.51×104个/ml、C组5.53×105±9.88×104个/ml,细胞存活率均在80%左右,三组间无显著差异。P3代hADSCs均高表达间充质干细胞阳性表面标志物CD44、CD73、CD90、CD105,混合阴性标志物CD34、CD11b、CD19、CD45及HLA-DR的表达均低于5%,各年龄组符合间充质干细胞表面标志物表达要求的hADSCs比例没有显著性差异。提示单纯年龄因素不影响单位体积脂肪组织中SVF含量和扩增中1ADSCs的纯度。2. SA-β-Gal染色计数结果显示老年组P5代hADSCs染色阳性细胞比例大于儿童组。进一步用MitoSOXTM荧光染色检测活细胞线粒体超氧化物表达,结果显示儿童组和青年组样本染色阴性,而老年组样本均呈阳性。流式细胞仪检测hADSCs过氧亚硝酸含量,结果显示随年龄增长过氧亚硝酸含量有升高趋势,老年组与儿童组有统计学差异。而且,老年组hADSCs的hTERT, SIRT1的表达水平较儿童组和青年组有下降趋势。以上结果提示老年组hADSCs老化程度更高。3.细胞增殖实验结果显示随供者年龄增长,]hADSCs增殖速率有减慢趋势,但各组间无显著差异。从细胞周期角度分析发现,老年组hADSCs处于S期的细胞比例较其他两组显著降低,原癌基因c-Jun、c-Fos表达也有降低趋势,且周期素依赖激酶抑制基因P21表达显著增高,提示老年组hADSCs可能发生了细胞周期阻滞,由G1期进入S期速率减慢。各年龄组hADSCs细胞凋亡分布状态及凋亡调控基因Bcl-2、NFκB、caspase8的表达水平无显著差异。上述结果提示随年龄增长,hADSCs的细胞周期发生改变,从而影响其增殖潜能。4. hADSCs成脂诱导早期(D4),儿童组成脂相关基因CEBPα、PPARyγ、adiponectin, LPL、FABP4的表达显著高于青年组和老年组,但诱导中晚期(D8,D12)差异消失。油红O染色及半定量分析显示三组在诱导不同时间点甘油三酯生成量无显著差异。而且成脂酶相关基因及能量代谢基因的表达在各组间无显著性差异。提示年龄因素对hADSCs的成脂分化潜能无显著影响。hADSCs成骨诱导早期(D7),老年组成骨相关基因RUNX2、OCN、OPN, BMP2的表达水平既显著低于儿童组。至诱导晚期(D21),茜素红染色半定量检测显示老年组成骨诱导矿化水平显著低于儿童组,且矿化基因OPN的表达显著低于儿童组。提示老年供者1iADSCs的成骨分化能力较儿童组显著降低。5.细胞迁移实验结果显示老年组hADSCs细胞迁移能力显著低于儿童组,进一步研究显示老年组]hADSCs趋化因子受体CXCR4 和 CXCR7的表达水平较儿童组有降低趋势,提示趋化因子受体表达降低可能是其迁移能力下降的原因之一。研究结论1.年龄因素对胸部皮下单位体积脂肪SVF含量及扩增的iADSCs纯度无显著影响。2.年龄因素影响ADSCs的老化程度：老年个体hADSCs老化程度更高,细胞内ROS含量升高导致氧化应激加强可能是其发生机制之一。3.年龄因素影响hADSCs的增殖能力：老年个体hADSCs出现增殖减缓的趋势,可能与老年组hADSCs发生周期阻滞有关。4.年龄因素影响hADSCs的分化潜能：老年个体hADSCs的体外成脂分化潜能无显著变化,但成骨分化潜能降低,提示老年患者自体hADSCs用于成骨相关治疗的可行性降低。5.年龄因素影响hADSCs的迁移能力：老年组hADSCs迁移能力降低,其表面趋化因子受体CXCR4和CXCR7表达水平下降可能是其原因之一。综上,年龄因素对胸部切取单位体积脂肪SVF含量没有显著影响；但随年龄增长,hADSCs老化程度更高,表现出增殖、分化及迁移能力的相应降低。本研究不仅检测了干细胞生物学表现的变化,而且对相应机制进行了初步探讨,为深入了解年龄因素对干细胞特性的影响及机制提供更丰富的信息,为不同年龄人群hADSCs的临床应用提供有效参考。
【关键词】：人脂肪间充质干细胞 干细胞老化 定向分化 细胞迁移
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R329.2
【目录】：
- 中文摘要4-7
- 英文摘要7-12
- 引言12-14
- 材料与方法14-30
- 结果30-44
- 讨论44-55
- 结论55-56
- 参考文献56-63
- 文献综述63-73
- 参考文献68-73
- 英文缩略词73-75
- 致谢75-76
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前2条
1 侯恺林;郝e，
本文编号：671476
本文链接：https://www.wllwen.com/shoufeilunwen/jckxbs/671476.html
