共翻译分子伴侣RAC与80S核糖体复合物结构研究
发布时间:2017-08-18 22:10
本文关键词:共翻译分子伴侣RAC与80S核糖体复合物结构研究
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【摘要】:核糖体是具有复杂结构的蛋白核酸复合物,在生物体内的主要功能是进行蛋白质的翻译。当新生肽链从核糖体上翻译生成时,容易发生聚集以及错误的折叠。生物体内进化出了一系列与核糖体相结合的共翻译分子伴侣来对新生肽链进行及时的保护和初步的折叠。在真核生物中,主要的共翻译分子伴侣有NAC和RAC/SSB系统。在RAC/SSB系统中,Hsp40蛋白Zuotin和Hsp70蛋白Ssz能形成稳定的二元复合物RAC,RAC能够通过Zuotin与核糖体相结合。Zuotin的Jdomian结构域能够特异性的刺激Hsp70蛋白Ssb的ATP酶活性,促使Ssb将ATP水解为ADP。ADP状态下的Ssb能够紧密的结合新生肽链,发挥共翻译分子伴侣的功能。更为重要的是,越来越多的证据表明共翻译分子伴侣能够对核糖体的翻译起到调控作用。到目前为止RAC/SSB系统在核糖体上发挥功能的具体机制尚不明确。我们在大肠杆菌中过量表达并分离纯化得到了RAC和Zuotin蛋白。通过蔗糖密度梯度离心的方法分离得到了酵母80S核糖体。在Titan Krios和F20冷冻透射电镜下收集了大量数据,通过多轮三维分类和三维重构最终解析了高分辨率的RAC?80S核糖体复合物结构。RAC与80S核糖体的大小亚基都有结合。RAC在大亚基上与L31,L22,H59和H101相结合,在小亚基上与ES12相结合。在溶液中,核糖体两个亚基之间能够自发的旋转,RAC能与不同旋转状态下的80S核糖体相结合。Zuotin的中间结构域MD是由一根含有大量带电氨基酸的α螺旋所构成。RAC与核糖体大小亚基的结合主要是通过Zuotin MD的α螺旋以静电相互作用的方式介导。MD在RAC与核糖体之间起到了双向信息传递的作用:一方面小亚基发生旋转的构象变化信息能够通过MD传递到Zuotin N端,使J-domain更加靠近肽链出口位置,有助于发挥共翻译分子伴侣的功能。另一方面,MD能够通过抑制小亚基的旋转,来降低核糖体的翻译速率。翻译速率的降低有助于共翻译分子伴侣对新生肽链进行及时的保护。通过酵母生长实验我们证明MD的带电性、刚性以及最适长度对酵母的正常生长是必需的。我们的结构研究不仅揭示了RAC在核糖体上的空间定位,还阐释了共翻译分子伴侣RAC对核糖体翻译的调控机制。
【关键词】:共翻译分子伴侣 核糖体 冷冻电镜 RAC Ssb
【学位授予单位】:清华大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:Q75
【目录】:
- 摘要3-4
- Abstract4-10
- 第1章 引言10-34
- 1.1 真核生物核糖体的组成和结构10-15
- 1.1.1 核糖体高分辨结构的研究历史10-12
- 1.1.2 真核生物核糖体的结构特征12-15
- 1.2 真核生物蛋白质的翻译过程15-17
- 1.3 新生肽链需要共翻译分子伴侣的折叠和保护17-26
- 1.3.1 蛋白质的折叠17-21
- 1.3.2 原核生物的共翻译分子伴侣TF21
- 1.3.3 真核生物的共翻译分子伴侣NAC21-22
- 1.3.4 真核生物的共翻译分子伴侣RAC22-25
- 1.3.5 RAC与核糖体复合物结构的研究25-26
- 1.4 冷冻电镜背景介绍26-31
- 1.4.1 电子辐照损伤和低信噪比27-28
- 1.4.2 中心截面定理28-29
- 1.4.3 单颗粒三维重构29
- 1.4.4 电镜结构的验证和评估29-31
- 1.5 本课题的研究意义31-34
- 第2章 材料与方法34-66
- 2.1 实验仪器34-35
- 2.2 实验缓冲液35-36
- 2.3 蛋白的表达纯化36-44
- 2.3.1 载体的构建36-39
- 2.3.2 蛋白的诱导表达39-40
- 2.3.3 蛋白质的纯化40-44
- 2.4 酿酒酵母核糖体的分离纯化44-47
- 2.4.1 酿酒酵母总核糖体的粗提44-45
- 2.4.2 酿酒酵母 80S核糖体的分离45-47
- 2.5 冷冻样品的制备47-52
- 2.5.1 铜网的预处理47-48
- 2.5.2 碳膜的喷镀和捞取48-50
- 2.5.3 冷冻样品的制备流程50-52
- 2.6 冷冻样品的数据收集52-59
- 2.6.1 冷冻上样52-54
- 2.6.2 电镜状态的调节54-57
- 2.6.3 数据的手动收集57-58
- 2.6.4 高通量自动化数据收集58-59
- 2.7 冷冻样品的数据处理59-66
- 2.7.1 图片的预处理60
- 2.7.2 计算欠焦值60-62
- 2.7.3 图片的筛选62-63
- 2.7.4 颗粒的自动挖取63-64
- 2.7.5 对颗粒的二维分类64
- 2.7.6 对颗粒的三维分类64-65
- 2.7.7 三维重构迭代、振幅校正和分辨率评估65-66
- 第3章 实验结果及分析66-113
- 3.1 蛋白质的纯化结果66-68
- 3.2 核糖体的提取纯化结果68-70
- 3.3 在数据收集和处理过程中的一些创新性思路70-76
- 3.3.1 冷冻样品储存盒的改良70-71
- 3.3.2 一种挑选square的方式71-72
- 3.3.3 对图片的实时监测和运算72-73
- 3.3.4 一种筛选颗粒的方法73-74
- 3.3.5 一种对star文件中的颗粒进行分组的方法74-75
- 3.3.6 基于Relion的supervised classification75-76
- 3.4 RAC与 80S核糖体复合物的结构及分析76-111
- 3.4.1 RAC与 80S核糖体复合物的结构特征76-77
- 3.4.2 RAC与 80S核糖体复合物高分辨结构的获取77-87
- 3.4.3 RAC在 80S核糖体上的结合位点87-89
- 3.4.4 Zuotin与Ssz在空间上的定位89-91
- 3.4.5 Zuotin通过MD与核糖体相结合的分子机制91-95
- 3.4.6 RAC的结合与ES27的构象无关95-97
- 3.4.7 核糖体的旋转能引起Zuotin N端发生构象变化97-99
- 3.4.8 Zuotin的结合能抑制核糖体的旋转99-106
- 3.4.9 MD是核糖体和RAC之间的双向信息传递者106
- 3.4.10 MD的带电性、刚性和长度在进化上非常保守106-108
- 3.4.11 MD的带电性、刚性和长度在功能上是必需的108-111
- 3.5 RAC/SSB系统的工作机制111-112
- 3.6 本章小结112-113
- 第4章 讨论与展望113-120
- 4.1 RAC可能会对核糖体解码中心产生影响113-114
- 4.2 RAC可能介导了蛋白质翻译与折叠的同步性114
- 4.3 共翻译因子在核糖体上的竞争关系114-116
- 4.4 直接电子探测器的应用可能有助于RAC的局部分类116-118
- 4.5 分辨率的追求与生物学问题的解决118-120
- 第5章 其它研究工作120-128
- 5.1 核糖体小亚基成熟因子YqeH的结构研究120-122
- 5.2 机械力敏感离子通道Ynai的结构研究122-124
- 5.3 炎症小体适配蛋白PYD结构域的螺旋结构研究124-126
- 5.4 分枝杆菌核糖体的结构研究126-128
- 参考文献128-141
- 致谢141-144
- 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果144
本文编号:697028
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