硫化氢参与植物细胞水涝低氧胁迫应答反应机制的研究

发布时间：2017-08-22 05:18

  本文关键词：硫化氢参与植物细胞水涝低氧胁迫应答反应机制的研究

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【摘要】：气候变化导致水涝灾害在全球范围内频繁发生,加之大多数农作物(例如豌豆)属于水涝敏感型植物,水涝灾害最终导致农作物产量明显下降以至绝收。这主要是因为水涝环境限制了空气尤其是氧气(O2)和二氧化碳(C02)的流动,使得植物细胞正常的光合作用和呼吸作用受阻。同时,大量有毒代谢产物在细胞中积累最终造成细胞死亡。硫化氢(H2S)作为一种新型气体信号分子参与动植物细胞的多种生物学过程,并作为02感受器调控动物细胞低氧胁迫应答反应,但至今尚无H2S参与植物细胞应答水涝低氧胁迫方面的报道。本研究以建立了完善水培体系的豌豆以及H2S代谢途径拟南芥突变体desl-1(L-cysteine desulfhydrase)为材料,通过生理生化、细胞和分子生物学多种技术在分子水平上研究了H2S缓解水涝低氧胁迫造成的植物细胞死亡的分子机制。主要研究结果如下：1、Evans Blue染色发现水涝低氧胁迫最先导致根尖过渡区(TZ)细胞死亡,且DAB(显示过氧化氢,H202)和NBT(显示超氧根离子,O2·-)组织化学染色显示ROS首先在TZ细胞中大量积累,表明根尖TZ细胞可能是感知水涝低氧胁迫最敏感的部位。2、豌豆幼苗经外源H2S(由NaHS水解产生)预处理后进行水涝低氧胁迫处理,通过Evans Blue染色观察发现NaHS预处理明显缓解了水涝低氧胁迫造成的根尖细胞死亡。同时,DAB和NBT组织化学染色发现NaHS预处理明显降低了ROS在TZ细胞中的积累。3、在NaHS预处理和水涝低氧胁迫处理阶段添加内源H2S合成酶抑制剂HA(hydroxylamine),可明显影响根尖内源H2S含量。Evans Blue染色显示根尖细胞死亡程度与内源H2S含量密切相关,表明H2S可能参与了植物细胞对水涝低氧胁迫的应答过程。4、NaHS预处理对乙醇发酵途径关键酶PDC (pyruvate decarboxylase)和ADH(alcohol dehydrogenase)的活性影响不显著,但明显增加了GSH(glutathione)的含量以及APX (ascorbate peroxidase)的活性,表明H2S主要是通过提高植物细胞抗氧化系统活性增强其耐受水涝低氧胁迫的能力。5、通过H2S和NO (nitric oxide)特异性荧光染料染色观察,发现NaHS预处理可明显增加拟南芥野生型内源H2S和NO含量；而突变体des1-1中H2S和NO含量明显低于野生型；Evans Blue染色结果也表明desl-1耐受水涝低氧胁迫能力明显低于野生型,表明H2S与NO相互作用共同调控植物细胞水涝低氧胁迫应答反应。6、基因DESl的突变明显影响了N-end rule途径中标志基因ATE1 (Arg-tRNA transferase), ATE2, PRT6 (proteolysis), HRE1 (hypoxia responsive), HRE2, RAP2.12 (related to AP2.12), PCO1 (plant cysteine oxidase)和PC02的表达量,表明H2S通过影响N-end rule途径关键基因的表达参与植物细胞对低氧水平的感知；同时DES1的突变也明显影响了ER stress标志基因bZIP17 (basic domain/leucine zipper), bZIP28, bZIP60, BiP (bindingprotein), TIN(tunicamycin induced)和ERO (ER oxidoreductase)的表达量,表明H2S通过影响蛋白质的正确折叠来调控水涝低氧胁迫引起的细胞死亡。7、NaHS预处理明显抑制了豌豆根尖细胞乙烯的产生和ACC氧化酶(ACC oxidase, ACO)活性。此外,基因DES1的突变明显上调了拟南芥突变体desl-1中乙烯受体基因ETR2 (ethylene receptor)的表达。结合Evans Blue染色以及根长测定结果,表明H2S通过抑制乙烯的合成和感知途径启动了静止生长策略,以降低水涝低氧胁迫下能量的过度消耗。8、为了进一步揭示H2S参与水涝低氧胁迫应答和调控细胞死亡的生理和分子机制,我们构建了H2S代谢途径关键基因OAS-Al(O-acetyl-L-serine(thiol)lyase)和DESl的35S启动子、自身启动子过表达载体以及RNAi载体,并成功转化到农杆菌GV3101中,以期获得OAS-Al和DES1过表达和RNAi转基因植株,并对这些转基因植株的水涝低氧胁迫耐受性进行分析。综上所述,H2S通过与NO、ROS以及植物激素乙烯等相互作用,共同调控植物细胞对水涝低氧胁迫的应答过程,最终缓解水涝低氧胁迫引起的植物细胞死亡。本研究不仅具有重要科学意义,同时还为提高农作物耐受水涝低氧胁迫提供新的研究思路。
【关键词】：硫化氢 低氧胁迫 细胞程序性死亡 内质网胁迫 ROS NO 乙烯
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q942.5
【目录】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-8
• 主要缩略词表8-13
• 第一章 绪论13-27
• 1.1 植物细胞水涝低氧胁迫的研究现状13-19
• 1.1.1 植物应答水涝低氧胁迫的遗传学机制13-15
• 1.1.2 水涝低氧胁迫造成植物细胞死亡的原因分析15-16
• 1.1.3 水涝低氧胁迫引起的植物细胞死亡可能是一种PCD过程16
• 1.1.4 植物细胞通过N-末端规则(N-end rule)感知低氧胁迫16-19
• 1.2 H_2S在植物细胞中的研究进展19-22
• 1.2.1 植物细胞对硫酸盐的同化19-20
• 1.2.2 H_2S在植物细胞中的合成和分解代谢20-21
• 1.2.3 H_2S作为信号分子参与植物细胞的许多生物学进程21-22
• 1.3 H_2S参与动物细胞低氧感知的研究现状22-24
• 1.3.1 动物细胞低氧感知机制22-23
• 1.3.2 H_2S是动物细胞的氧气感受器23-24
• 1.4 H_2S参与植物细胞水涝低氧胁迫研究进展和存在的问题24-25
• 1.5 本研究的切入点25-26
• 1.5.1 从ER stress角度研究H_2S参与植物细胞低氧感知的细胞和分子机制25-26
• 1.5.2 研究水涝低氧胁迫下植物细胞中H_2S与ROS以及NO之间的相互作用26
• 1.6 研究目的和意义26-27
• 第二章 H_2S增强豌豆耐受水涝低氧胁迫的研究27-51
• 2.1 材料与方法27-33
• 2.1.1 试剂27
• 2.1.2 实验材料培养、处理和取样27-28
• 2.1.3 根尖细胞死亡程度检测28-29
• 2.1.4 根部溶解氧含量测定29
• 2.1.5 O_2~(·-) 和H_2O_2的组织化学染色29
• 2.1.6 O_2~(·-)含量测定29
• 2.1.7 H_2O_2含量测定29-30
• 2.1.8 根尖内源H_2S含量测定30
• 2.1.9 H_2S代谢途径关键酶活性测定30-31
• 2.1.10 抗氧化系统APX、SOD和CAT酶活性测定31
• 2.1.11 GSH含量测定31-32
• 2.1.12 根尖细胞膜完整性检测32
• 2.1.13 乙烯含量和ACO活性测定32
• 2.1.14 发酵途径PDC、ADH和LDH酶活性分析32-33
• 2.1.15 数据统计33
• 2.2 结果33-45
• 2.2.1 水涝低氧胁迫导致ROS在根尖过渡区细胞大量积累33-35
• 2.2.2 H_2S预处理增强豌豆耐受水涝低氧胁迫以及水涝过后恢复生长的能力35-37
• 2.2.3 水涝低氧胁迫对豌豆根尖细胞内源H_2S含量的影响37
• 2.2.4 H_2S降低ROS在根尖细胞的积累37-39
• 2.2.5 H_2S增强根尖细胞抗氧化系统的能力39-40
• 2.2.6 H_2S对豌豆根尖细胞H_2S代谢途径关键酶活性的影响40-41
• 2.2.7 H_2S对根尖细胞发酵代谢途径酶活性的影响41-42
• 2.2.8 H_2S抑制根尖细胞乙烯的产生42-43
• 2.2.9 H_2S预处理增强豌豆根尖细胞膜的完整性43
• 2.2.10 H_2S可能参与植物细胞对水涝低氧胁迫的应答反应43-45
• 2.3 讨论45-49
• 2.3.1 豌豆根尖过渡区细胞可能是感知水涝低氧胁迫最敏感的部位45-46
• 2.3.2 H_2S通过抗氧化系统而不是发酵途径来增强豌豆耐受水涝低氧胁迫能力46-47
• 2.3.3 H_2S可能参与植物细胞水涝低氧胁迫应答过程47-49
• 2.4 小结49-51
• 第三章 H_2S代谢突变体des1-1水涝低氧胁迫耐受性研究51-66
• 3.1 材料与方法51-54
• 3.1.1 试剂51
• 3.1.2 实验材料培养、处理和取样51-52
• 3.1.3 叶片和根尖细胞死亡程度检测52
• 3.1.4 O_2~(·-)和H_2O_2的组织化学染色和含量测定52
• 3.1.5 H_2S代谢途径关键酶活性以及抗氧化系统活性测定52
• 3.1.6 根尖细胞膜完整性检测52
• 3.1.7 拟南芥CAS电泳图谱分析52-53
• 3.1.8 植物根尖细胞程序性死亡(PCD)检测53
• 3.1.9 植物根尖内源H_2S和NO荧光强度检测53-54
• 3.1.10 数据统计54
• 3.2 结果54-62
• 3.2.1 拟南芥水培体系以及水涝低氧胁迫处理体系的建立54-55
• 3.2.2 H_2S对拟南芥种子萌发和根伸长生长的影响55-56
• 3.2.3 H_2S预处理增强拟南芥耐受水涝低氧胁迫以及复氧后恢复生长的能力56-57
• 3.2.4 H_2S代谢途径突变体des1-1水涝低氧胁迫耐受性分析57-58
• 3.2.5 水涝低氧胁迫对拟南芥Col和des1-1内源H_2S含量的影响58-59
• 3.2.6 水涝低氧胁迫对CSase同工酶活性的影响59-60
• 3.2.7 水涝低氧胁迫对拟南芥Col和des1-1内源NO含量的影响60-61
• 3.2.8 水涝低氧胁迫造成的植物细胞死亡可能是一种PCD过程61-62
• 3.3 讨论62-65
• 3.3.1 H_2S对植物种子萌发和根生长的影响62-63
• 3.3.2 H_2S增强植物细胞水涝低氧胁迫耐受性具有普遍性63
• 3.3.3 H_2S与NO、ROS之间相互作用共同调控植物细胞应答水涝低氧胁迫63-65
• 3.4 小结65-66
• 第四章 H_2S在转录水平调控植物细胞水涝低氧胁迫应答的研究66-85
• 4.1 材料与方法66-69
• 4.1.1 试剂66
• 4.1.2 实验材料培养及取样方法66-67
• 4.1.3 RNA提取方法67
• 4.1.4 qRT-PCR方法67-69
• 4.2 结果69-77
• 4.2.1 H_2S对ROS产生和清除途径关键基因表达的影响69-70
• 4.2.2 H_2S对N-end rule途径关键基因表达的影响70-71
• 4.2.3 H_2S对植物细胞PCD途径关键基因表达的影响71-73
• 4.2.4 H_2S对植物细胞H_2S代谢途径关键基因表达的影响73-74
• 4.2.5 H_2S对ER stress途径关键基因表达的影响74-76
• 4.2.6 H_2S对中乙烯受体基因ETR2表达的影响76
• 4.2.7 H_2S对糖代谢及乙醇发酵代谢途径关键基因表达的影响76-77
• 4.3 讨论77-84
• 4.3.1 H_2S可能通过N-end rule途径参与植物细胞对低氧水平的感知77-79
• 4.3.2 H_2S可能通过抑制乙烯的合成和感知启动了静止生长策略79-81
• 4.3.3 H_2S可能通过ER-stress途径参与植物细胞水涝低氧胁迫应答反应81-84
• 4.4 小结84-85
• 第五章 DES1和OASA1过表达及RNAi载体构建和遗传转化85-95
• 5.1 材料与方法85-87
• 5.1.1 菌株和质粒85
• 5.1.2 试剂、酶和引物85
• 5.1.3 DES1和OASA1基因RNAi载体构建85-86
• 5.1.4 DES1和OASA1基因自身启动子和35S启动子过表达载体构建86-87
• 5.1.5 农杆菌GV3101转化实验87
• 5.1.6 花絮浸染法转化拟南芥实验87
• 5.2 结果87-93
• 5.2.1 DES1/OASA1-RNAi载体构建87-91
• 5.2.2 DES1/OASA1-35S和自身启动子过表达载体构建91-93
• 5.3 讨论和小结93-95
• 第六章 结论与展望95-99
• 6.1 结论95-97
• 6.1.1 H_2S增强植物耐受水涝低氧胁迫能力具有普遍性和实际应用价值95
• 6.1.2 H_2S通过增强细胞抗氧化胁迫能力提高植物水涝低氧胁迫耐受性95
• 6.1.3 H_2S通过抑制乙烯的合成和感知启动了植物细胞静止生长策略95-96
• 6.1.4 H_2S通过N-end rule和ER stress途径调控植物水涝低氧胁迫应答过程96-97
• 6.2 展望97-99
• 6.2.1 拟南芥H_2S代谢途径另一重要突变体oasa1水涝低氧胁迫耐受性分析97-98
• 6.2.2 拟南芥ER stress代谢途径突变体水涝低氧胁迫耐受性分析98
• 6.2.3 H_2S与其它植物激素共同调控水涝低氧胁迫下植物静止生长策略的研究98-99
• 本研究创新点99-100
• 参考文献100-109
• 就读期间主要研究成果109-110
• 致谢110-111

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 ;Hydrogen sulfide induced by nitric oxide mediates ethylene-induced stomatal closure of Arabidopsis thaliana[J];Chinese Science Bulletin;2011年33期

2 ;Hydrogen Sulfide Promotes Wheat Seed Germination and Alleviates Oxidative Damage against Copper Stress[J];Journal of Integrative Plant Biology;2008年12期

3 ;Hydrogen Sulfide Promotes Root Organogenesis in Ipomoea batatas, Salix matsudana and Glycine max[J];Journal of Integrative Plant Biology;2009年12期

4 Francesco Licausi;Chiara Pucciariello;Pierdomenico Perata;;New Role for an Old Rule: N-end Rule-Mediated Degradation of Ethylene Responsive Factor Proteins Governs Low Oxygen Response in Plants[J];Journal of Integrative Plant Biology;2013年01期

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本文编号：717268