植物脱落酸受体PYL10在脱落酸结合前后的液体核磁共振动态特性研究

发布时间：2017-08-30 21:31

  本文关键词：植物脱落酸受体PYL10在脱落酸结合前后的液体核磁共振动态特性研究

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【摘要】：蛋白质是生物体行使功能的最重要的生物大分子之一,研究蛋白质在生理过程中的作用机制能够帮助我们更好的了解生命的意义。大部分蛋白质功能的实现依赖着其动态变化,核磁共振由于能够研究生物大分子在不同时间尺度上的运动特性而成为研究蛋白质动力学和作用机制的重要工具。本文应用生物化学方法分析了植物激素脱落酸(ABA)在拟南芥中的水溶性受体家族RCAR1/PYR/PYL中的成员PYL10对其下游信号因子2C类蛋白磷酸酶PP2C的作用机制。纠正了前人因偶然因素得出“PYL10是一类不依赖于ABA的受体”的结论。本文还进一步应用液体核磁共振弛豫测量和约化谱密度函数分析方法揭示了PYL10在ABA结合前后的动态特性,表明PYL10在结合ABA之后使得其结构熵和蛋白质柔性的增加。同时,本文还介绍了发展和应用无标记(Label-Free)质谱定量检测的方法研究大肠杆菌酪氨酸激酶C端酶活结构域(ETK-CTD)在磷酸化过程中的关键位点Tyr574的磷酸化水平的动态变化的工作,及简要介绍了植物内向整流钾离子通道KAT1的初步电生理研究。 第一章先简要介绍了ABA受体的发现和分类。接着对水溶性的ABA受体RCAR1/PYR/PYL家族介导的ABA信号通路的主要内容及其在植物体中的重要功能、RCARl/PYR/PYL家族ABA受体结合ABA时的结构变化和发挥作用的机制进行了重点介绍。 第二章主要介绍了基于液体核磁共振自旋弛豫的蛋白质动力学分析方法,并相关研究表明热力学原理和动力学的结合能够更好地解释蛋白质-配体或者蛋白质-蛋白质相互作用机制。 第三章介绍了采用钼酸盐与磷酸根的显色反应检测PYL10在体外对PP2C(HAB1)磷酸酶活性的抑制,发现了与之前报道的结果(ABA非依赖性)相反的结果,即ABA依赖性,且这种依赖性会受到外源蛋白牛血清蛋白(BSA)的影响。生化分析结果表明PYL10和BSA不能形成稳定的复合物。 第四章针对BSA不是通过与PYL10直接相互作用影响其功能,可能是使PYL10蛋白的动力学发生了变化而对功能产生影响。我们对自由状态的PYL10(apo-PYL10)和结合有ABA的PYL10(ABA/PYL10)进行了液体核磁共振主链归属、弛豫数据的采集和约化谱密度函数分析以及ABA滴定实验,结果表明PYL10对PP2C的磷酸酶活性抑制作用是通过ABA介导的主链柔性以及构象熵的增加实现的。 第五章我们分别采用Label-Free质谱相对定量和Western-blot定性分析了ETK-CTD在磷酸化过程中自磷酸化位点Tyr574磷酸化水平的变化和蛋白质总磷酸化水平变化。质谱结果表明,ETK-CTD的Tyr574位点的磷酸化很快达到一个较低的稳定水平(1%)；而Western-blot结果显示,在Tyr574达到这个稳定水平后蛋白总体磷酸化依然升高最后保持稳定,表明仅仅一个很低水平的自磷酸化(大约1%)已经足够使得蛋白质本身完成交叉磷酸化并使蛋白达到一个稳定的磷酸化水平。 第六章简单介绍了一些植内向整流钾离子通道KAT1的前期工作。
【关键词】：液体核磁共振 弛豫 柔性 构象熵 脱落酸受体 蛋白质酪氨酸激酶 无标记定量质谱检测
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q946
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-9
• 目录9-13
• 第一章 脱落酸RCAR1/PYR1/PYL受体的介绍13-29
• 1.1 脱落酸(ABA)受体的发现13-17
• 1.1.1 花期控制蛋白A(FCA)13-14
• 1.1.2 叶绿体的镁离子螫合酶H亚基(ChIH)14
• 1.1.3 G蛋白偶联受体类(GCR2>G1>G2)14-15
• 1.1.4 ABA受体调节元件/pyrabactin抵抗蛋白/pyrabactin抵抗类似蛋白(RCAR1/PYR/PYL)15-17
• 1.2 RCAR/PYR/PYL介导的ABA信号通路简介17-24
• 1.2.1 信号通路核心17-18
• 1.2.2 PYLs介导的ABA信号通路的主要功能18-20
• 1.2.3 PYLs结构与功能的研究20-21
• 1.2.4 ABA与PYLs的结合抑制PP2Cs的机制研究现状21-24
• 参考文献24-29
• 第二章 基于液体NMR自旋弛豫的蛋白质动力学分析29-41
• 2.1 概述29
• 2.2 液体核磁共振研究蛋白质动力学的方法29-34
• 2.2.1 弛豫时间(T_1,T_2)和异核NOEs的测量29-30
• 2.2.2 谱密度函数30
• 2.2.3 Model-Free方法30-31
• 2.2.4 蛋白质侧链动力学31-32
• 2.2.5 化学交换32-33
• 2.2.6 CPMG弛豫色散33-34
• 2.2.7 射频场中的演化：R_(1ρ)弛豫34
• 2.3 热力学原理在蛋白质动力学中的应用34-36
• 2.4 总结36-37
• 参考文献37-41
• 第三章 PYL10对PP2C的磷酸酶活性的抑制依赖ABA的作用41-57
• 3.1 前言41
• 3.2 钼酸盐方法定量检测蛋白质磷酸酶的活性41-42
• 3.3 实验材料与方法42-47
• 3.3.1 重组蛋白表达载体的构建42-45
• 3.3.2 PYL10,PYL2-wt,PYL2-m与HAB1_(172-511)的过表达及纯化45-47
• 3.3.3 “钼蓝”法测量PP2C磷酸酶活性47
• 3.3.4 等温滴定量热法(ITC)分析47
• 3.4 结果和讨论47-55
• 3.4.1 PYL10、PYL2-wt、PYL2-m以及HAB1_(172-511)蛋白质的纯化48-50
• 3.4.2 PYL10对PP2C的抑制作用可能不受渗透压的直接影响50-51
• 3.4.3 PYL10对PP2C的抑制作用可以同时被ABA和BSA增强51-53
• 3.4.4 ABA与PYL10的结合伴随着焓减53-55
• 参考文献55-57
• 第四章 ABA结合前后PYL10的动力学变化57-73
• 4.1 前言57
• 4.2 实验材料与方法57-59
• 4.2.1 用于NMR实验的PYL10的表达与纯化57-58
• 4.2.2 NMR三维实验和主链归属58-59
• 4.2.3 主链弛豫测量59
• 4.2.4 ABA滴定实验59
• 4.3 结果和讨论59-68
• 4.3.1 PYL10在有无ABA存在下的液体核磁共振的主链归属59-60
• 4.3.2 ABA/PYL10在纳秒尺度上的柔性比apo-PYL10大60-64
• 4.3.3 约化谱密度函数J(0)在apo-PYL10和ABA/PYL10结构上的映射64-65
• 4.3.4 ABA滴定过程中PYL10的构象交换65-68
• 4.4 总结和展望68-70
• 参考文献70-73
• 第五章 运用Label-Free质谱定量分析大肠杆菌酪氨酸激酶ETK催化结构域的磷酸化变化73-99
• 5.1 背景介绍73-81
• 5.1.1 细菌酪氨酸激酶的介绍73-74
• 5.1.2 大肠杆菌K12酪氨酸激酶(ETK)的研究现状74-77
• 5.1.3 基于质谱的蛋白质组学的定量检测方法77-81
• 5.2 实验材料和方法81-85
• 5.2.1 实验仪器及质粒来源81
• 5.2.2 ETK-CTD和蛋白质酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)蛋白的表达纯化81-82
• 5.2.3 免疫印迹(western-blot)检测82
• 5.2.4 体外激酶活性实验及检测82-83
• 5.2.5 质谱检测以及数据分析83-85
• 5.3 结果与讨论85-94
• 5.3.1 ETK-CTD和PTP1B蛋白质的纯化85-86
• 5.3.2 体外磷酸化实验以及质谱样品的制备86-87
• 5.3.3 液相串联质谱(LC-MS/MS)能检测的胰蛋白酶酶切的ETK-CTD肽段87-88
• 5.3.4 LC-MS/MS检测ETK-CTD的磷酸化肽段88-90
• 5.3.5 定量分析ETK-CTD中Tyr574位点磷酸化水平的变化90-92
• 5.3.6 用western-blot检测ETK-CTD的总体磷酸化变化92-94
• 5.4 讨论和总结94-95
• 参考文献95-99
• 第六章 植物内向整流钾离子通道KAT1的功能研究初探99-111
• 6.1 背景介绍99-103
• 6.1.1 植物钾离子通道的分类99-100
• 6.1.2 KAT1的研究现状100-103
• 6.2 实验材料和方法103-105
• 6.2.1 重组质粒的构建103-104
• 6.2.2 细胞转染和电生理记录104-105
• 6.3 实验结果和讨论105-108
• 参考文献108-111
• 附录1 培养基的配制111-112
• 附录2 缓冲溶液的配制112-114
• 致谢114

【共引文献】

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