利用细菌人工染色体制备乳过氧化物酶小鼠乳腺反应器的研究

发布时间：2017-09-05 19:41

  本文关键词：利用细菌人工染色体制备乳过氧化物酶小鼠乳腺反应器的研究

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【摘要】：乳腺生物反应器是一种具有广泛应用前景的蛋白生产模式。构建乳腺特异表达载体时常选用乳蛋白基因的启动子,常用的乳蛋白基因包括酪蛋白、乳清酸蛋白、乳清白蛋白、乳球蛋白基因等。有研究表明乳铁蛋白基因启动子也可用于调控外源基因的乳腺特异表达。利用细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome, BAC)载体制备乳腺反应器具有调控区完整、不受位置效应影响、表达量可与插入拷贝数呈正相关等优点。因此本研究用BAC载体进行外源基因的小鼠乳腺反应器的研究,验证其作为稳定高效的表达载体调控外源基因在乳腺中表达的能力。本研究选用牛乳过氧化物酶基因(bovine lactoperoxidase, bLPO)进行小鼠乳腺反应器模型制备。牛乳过氧化物酶与过氧化氢、硫氰化物共同组成具有天然抗菌作用的乳过氧化物酶系统,除广谱抗菌作用外还具有抗真菌、抗病毒、抗自由基、促进免疫等生物功能,因此该蛋白在生产生活中有极高的应用价值。本研究比较了携带有3种不同启动子的BAC载体在小鼠中调控外源基因bLPO表达的能力。3种启动子分别为bLPO自身启动子、αs1酪蛋白启动子、乳铁蛋白启动子。本研究制备了3种BAC载体调控bLPO表达的转基因小鼠,鉴定了转基因鼠中bLPO基因的插入与表达情况。结果表明bLPO自身启动子不能调控bLPO蛋白在乳腺中表达,仅在mRNA水平检测到有少量表达；αs1酪蛋白启动子、乳铁蛋白启动子均可调控bLPO的重组表达。乳铁蛋白BAC载体表达的重组bLPO在个别个体中表达量最高,但αs1酪蛋白的BAC载体表达的重组bLPO在不同个体的平均表达量高于乳铁蛋白BAC载体。Western blotting与去糖基化酶实验表明重组bLPO与天然bLPO具有相似的N-糖基化修饰,但分子量略有差异。酪蛋白启动子调控的转基因小鼠乳汁中重组LPO的浓度为0.118 μg/μL～0.216 μg/μL之间,乳铁启动子转基因小鼠乳中重组LPO的表达量在0.041μg/μL～0.364 μg/μL之间,两种转基因鼠乳汁中的重组bLPO均高于牛乳中bLPO的浓度(～0.03μg/μL)。本研究采用了ABTS法测定bLPO的酶活性,显示1微升转基因鼠乳中LPO酶活力(U/mL)在0.0198～0.0261之间,相当于1微克标准品bLPO酶活力的56.1%～73.9%,酶活与bLPO的含量呈正相关。抑菌圈法检测重组bLPO的抑菌活性,发现转基因鼠奶可以抑制大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的生长形成抑菌圈。本研究成功获得了表达bLPO的转基因鼠。αs1酪蛋白和乳铁蛋白BAC载体均可在小鼠乳腺特异驱动表达bLPO, rbLPO表达水平最高达0.364μg/μL,说明BAC可以作为制备乳腺反应器的有效载体提高外源基因的表达量,可应用于转基因动物模型制备、研究外源蛋白功能以及大规模生产乳腺反应器等领域。
【关键词】：细菌人工染色体 乳腺生物反应器 乳过氧化物酶
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q81;Q78
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-7
• 缩略词7-8
• 第一章 文献综述8-36
• 1.1 转基因动物研究进展8-21
• 1.2 乳腺生物反应器研究进展21-26
• 1.3 乳过氧化物酶概述26-35
• 1.4 目的和意义35-36
• 第二章 材料与方法36-58
• 2.1 实验材料36
• 2.2 常用试剂与溶液36-39
• 2.3 实验仪器及耗材39-40
• 2.4 实验分析软件40
• 2.5 实验方法40-58
• 第三章 利用BAC载体在小鼠乳腺中表达乳过氧化物酶58-98
• 3.1 乳过氧化物酶BAC表达载体的构建及鉴定58-66
• 3.2 转基因小鼠的制备66-67
• 3.3 乳过氧化物酶小鼠模型鉴定67-85
• 3.4 重组牛乳过氧化物酶的定量检测与活性评价85-95
• 3.5 分析与讨论95-98
• 第四章 结论98-99
• 参考文献99-117
• 致谢117-118
• 附录118-127
• 个人简介127-128

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本文编号：799919