新型木质纤维素复合酶系协同降解效果及机理研究

发布时间：2017-09-05 23:02

  本文关键词：新型木质纤维素复合酶系协同降解效果及机理研究

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【摘要】：农业废弃物和能源作物等木质纤维素原料是丰富的可再生资源。充分利用木质纤维素原料发酵生产生物能源(乙醇、沼气等)是目前木质纤维素定向生物转化利用的研究热点。纤维素乙醇的生产工艺中,预处理和水解酶成本高是急需改善的两个关键环节。现有预处理方式不能完全去除木质素组分,残留木质素对后续水解酶的活力具有强的抑制作用,而且使其产生无效吸附。因此,研究木质素酶的降解作用及与纤维素酶、半纤维素酶的协同降解效果,进而在降低纤维素水解酶成本的同时实现高的可发酵糖得率,是纤维素乙醇生物加工过程中亟待解决的关键问题。本研究中,对实验室前期筛选的一株耐低温的高效木质素选择性降解菌株枝孢霉Ch2-2(Cladosporium cladosporioides Ch2-2),优化确定了其木质素酶的制备方法。通过优化Ch2-2木质素酶与商品纤维素酶和木聚糖酶的用量以及糖化温度条件,获得含有Ch2-2木质素酶和商品木聚糖酶的高效木质纤维素复合酶系,在以菊芋茎秆为底物、28℃常温条件下,二者之间的协同系数高达4.7,同时还原糖量达10.1 mg/mL,可替代目前价格昂贵、温度条件要求高的商品化纤维素酶。研究表明木质素酶和木聚糖酶具有明显的协同效果。通过宏基因组测序及信息分析,对木聚糖酶高产菌群EMSD5的天然协同降解模式进行了研究。结果表明,EMSD5木质纤维素降解酶基因中,糖苷水解酶基因所占比例高达52.35%,表明糖苷水解酶为主要分泌酶。其中,乙酰木聚糖酯酶、木聚糖酶所占比例较多,表明前者通过水解半纤维素侧链酯键,与木聚糖酶协同作用,促进半纤维素的降解,是木质纤维素降解的主要辅助酶；内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶所占比例较小,表明EMSD5高效降解酶系并非需要大量纤维素酶。获得具有多种木质纤维素酶功能结构域的新基因资源,推断纤维素酶、半纤维素酶、酯酶、辅助氧化酶之间均存在协同作用。此外,存在大量木质纤维素酶催化结构域带有碳水化合物结合模块CBM(11.92%),此类催化结构域的来源包括酯酶、糖苷转移酶、糖苷水解酶、氧化酶、多糖裂解酶,表明分泌携带碳水化合物结合模块CBM的游离酶的催化机制在EMSD5降解木质纤维素过程中发挥主要作用,是细菌菌群的降解新模式。同时发现EMSD5中存在编码SusE类型的外膜蛋白结构域与半纤维素酶类催化结构域相连的催化模式,这在以前的研究中尚未见报道。说明高效木质纤维素降解菌群EMSD5中,存在天然木质纤维素降解新模式,这为木质纤维素代谢途径的人工合成提供了新的策略,为工业复合酶制剂的开发应用提供理论依据。基于宏基因组测序信息,从EMSD5中扩增得到来源于GH11家族的木聚糖酶新基因exyl-his,同时扩增获得来源于黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)的锰过氧化物酶基因pcmnp-his,分别在毕赤酵母中进行分泌表达。利用获得的纯酶Exy1、PcMnP协同降解菊芋茎秆,首次提出并证明了木聚糖酶与锰过氧化物酶之间存在协同作用,为复合酶系协同机制的深入研究提供了新的视角。
【关键词】：木质纤维素复合酶系 协同作用 木聚糖酶 锰过氧化物酶 宏基因组
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TQ223.122;Q939.9
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 缩略词一览表9-10
• 第一章 引言10-26
• 1.1 木质纤维素结构及降解复合酶10-14
• 1.2 木质纤维素降解酶的协同作用14-18
• 1.3 木质纤维素降解酶的作用模式18-20
• 1.4 菌群的木质纤维素代谢途径20-22
• 1.5 宏基因组学分析技术22-23
• 1.6 本课题的研究目的及意义23-26
• 第二章 材料与方法26-40
• 2.1 菌株和质粒26
• 2.2 培养基和试剂26-27
• 2.3 重组表达载体pPIC9K-pcmnp-his的构建27-28
• 2.4 毕赤酵母GS115感受态制备28
• 2.5 重组载体pPIC9K-pcmnp-his转化毕赤酵母28
• 2.6 毕赤酵母转化子筛选鉴定28-29
• 2.7 重组载体pPIC9K-pcmnp-his在毕赤酵母中的诱导表达29
• 2.8 锰过氧化物酶活性的检测29
• 2.9 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)29-30
• 2.10 蛋白浓度的测定30
• 2.11 滤纸酶活(FPA,filter paper activity)的检测30-31
• 2.12 外切葡聚糖酶活性的检测31
• 2.13 内切葡聚糖酶活性的测定31-32
• 2.14 木聚糖酶活性的检测32
• 2.15 漆酶活性的检测32
• 2.16 LiP活性的检测32
• 2.17 复合酶水解体系的构建32-33
• 2.18 协同系数的计算33
• 2.19 菌群EMSD5基因组DNA的提取33
• 2.20 菌群EMSD5的保存33
• 2.21 菌群EMSD5的活化33-34
• 2.22 菌群EMSD5产酶34
• 2.23 Ch2-2种子液制备34
• 2.24 Ch2-2液体产酶34
• 2.25 Ch2-2粗酶粉的制备34
• 2.26 复合酶体系的构建34-35
• 2.27 还原糖浓度的测定35
• 2.28 重组蛋白的纯化35-36
• 2.29 EMSD5宏基因组测序36-40
• 第三章 实验结果与分析40-100
• 3.1 包含木质素酶的Ch2-2胞外酶与纤维素酶、木聚糖酶的协同降解效果40-55
• 3.1.1 枝孢霉Ch2-2木质素酶粗酶的制备及其协同降解效果40-45
• 3.1.2 复合酶系的优化及其中低温适应特性45-54
• 3.1.3 小结54-55
• 3.2 木质纤维素降解菌群EMSD5的群落结构和降解模式55-90
• 3.2.1 菌群EMSD5胞外酶活力检测55-56
• 3.2.2 菌群EMSD5基因组DNA的提取56-57
• 3.2.3 数据预处理57
• 3.2.4 组装57-59
• 3.2.5 基因预测59
• 3.2.6 物种注释59-62
• 3.2.7 功能注释62-85
• 3.2.8 木质纤维素酶的降解模式分析85-89
• 3.2.9 小结89-90
• 3.3 锰过氧化物酶与木聚糖酶的协同作用90-100
• 3.3.1 携带His标签的锰过氧化物酶基因pcmnp-his的异源表达90-93
• 3.3.2 菌群EMSD5木聚糖酶新基因的扩增93-95
• 3.3.3 携带His标签的木聚糖酶基因exyl-his的异源表达95-97
• 3.3.4 锰过氧化物酶PcMnP与木聚糖酶Exy1协同降解菊芋茎秆97-99
• 3.3.5 小结99-100
• 第四章 讨论与展望100-104
• 4.1 讨论100-102
• 4.2 创新点102-103
• 4.3 展望103-104
• 参考文献104-114
• 致谢114-116
• 个人简介116

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本文编号：800681