海洋微藻DNA条形码基因的评估及环境样本多样性分析和定量基因的开发
本文关键词：海洋微藻DNA条形码基因的评估及环境样本多样性分析和定量基因的开发
更多相关文章： DNA条形码 硅藻 甲藻 rDNA actin Miseq测序 群落结构
【摘要】：海洋微藻不仅在海洋生态系统中占有十分重要的生态地位,而且其结构成分和分泌物等是巨大的可开发利用的海洋资源,而硅藻和甲藻是海洋微藻的主要类群,因此,对其进行准确地分类鉴定是其他相关工作的研究基础。DNA条形码技术作为传统分类学鉴定的补充手段发挥了非常重要的作用。但硅藻和甲藻的DNA条形码研究起步较晚,尚未找到分别适合的统一的DNA条形码基因,现有的研究也主要是分别针对特定的分类单元进行条形码基因的检测,并未在整个类群上对候选基因进行过评估。此外,目前对海洋微藻群落结构的研究,一是显微镜检,但该方法受限于形态学鉴定的局限性,二是利用rDNA的扩增子测序信息来反映群落中微藻的组成结构,但rDNA在不同真核生物中的的拷贝数差异很大。因此根据rDNA扩增子测序所得的序列丰度对环境样本中真核微生物群落的相应物种的丰度评估可能存在误差。一些拷贝数较少的核编码的蛋白基因已被用于甲藻的系统发育分析,将此类基因用于群落结构分析,结果应该会更加准确。因而,本文针对研究较为广泛的硅藻,对选取的候选条形码基因rDNA ITS rDNA、COI和rbcL,分别进行通用引物的设计和验证,联合NCBI上的序列计算硅藻门各基因的遗传差异并构建贝叶斯树,评估其在硅藻门内物种的聚类情况,以分析各段标记适用于硅藻聚类关系中的分类单位；然后利用硅藻模拟混合样本进行rDNA扩增子克隆测序,评估rDNA序列的丰度反应环境样本中真核微生物群落的相应物种丰度的准确性；并对具有一定的甲藻物种区分能力的拷贝数较低的核编码蛋白基因(HSP90、elf2、actin)设计通用引物,分析其对甲藻物种的区分度后,利用甲藻模拟群落和选定的actin基因构建克隆文库初步评估该基因对甲藻物种进行定量的准确性;最后比较18S v9区和actin基因的Miseq测序测序结果,进行硅藻和甲藻模拟群落的物种丰度和多样性分析,并建立基因序列与生物量之间的关系。得到的结果如下：利用设计的通用引物将18S rDNA、ITS rDNA、COI和rbcL基因在分离的37株硅藻中均获得了扩增和测序,测得的序列Blast结果显示,rbcL基因的正确率最高(88.9%),18S次之,而COI的错误率最高(25%)。遗传差异和构建的贝叶斯树显示,18S rDNA的遗传变异度比较适中,可以在较高的分类水平上对硅藻进行聚类,也可以对直链藻属、楔形藻属、骨条藻属和双肋藻科等较低分类单位进行聚类分析。ITS和COI基因在硅藻门内遗传变异的程度很大,不再适用于较高分类单位的聚类分析,但是ITS适合用于海链藻目物种的DNA条形码鉴定和系统发育分析,而COI则更适合于羽纹硅藻的一些属的物种聚类分析和DNA条形码鉴定。rbcL基因相对18S更加保守,但是并不能在高分类阶元上进行硅藻的聚类分析,却可以聚类异极藻属、骨条藻属、冠盘藻科和根管藻科等个别较低分类单位的物种序列。利用rDNA扩增子测序进行微藻群落中物种丰度的分析结果,以DNA为模板比以藻液为模板所构建的克隆文库检测到的物种多,但都只检测出少量物种并存在相同的物种扩增偏好性,且两个文库检测到的物种的比例与样本的细胞比例差异很大,一方面说明rDNA在不同硅藻物种中的拷贝数存在很大差异,另一方面说明rDNA构建克隆文库评估硅藻群落甚至真核微生物的组成结构存在很大误差。同时还检测到在不同的硅藻培养物内都存在ITS序列变异,但是变异程度很小(p0.013)。对拷贝数较少的核编码的蛋白基因HSP90、elf2和actin基因设计通用引物并在8株甲藻中进行扩增和聚类分析,结果显示actin基因在扩增率、序列可利用率和物种的区分能力上均显示了一定的优势,基本上可以将甲藻在属水平进行区分和聚类。甲藻混合样本的actin基因克隆文库的构建和分析结果显示,actin基因能够将8个物种全部检出,序列与细胞的比例尚存在误差,但在属水平的误差要小于种水平的误差,物种检出率高于rDNA,丰度偏差低于rDNA。采用Miseq测序对7个模拟的硅藻和甲藻混合样本分别进行了18S v9区和actin基因的测序分析结果显示,rDNA扩增子测序进行微藻群落结构分析的误差很大,用18S rDNA扩增微藻群落容易受真菌等的影响；而actin基因的引物对甲藻的扩增具有特异性,actin可在属水平上更接近地反应群落实际的物种丰度,且能够而更为准确的反应样本间的聚类关系。故本文认为actin基因作为环境生态系统中真核微生物群落结构分析的分子标记,比rDNA更具优势。
【关键词】：DNA条形码 硅藻 甲藻 rDNA actin Miseq测序 群落结构
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q943.2
【目录】：
- 摘要5-7
- ABSTRACT7-14
- 第一章 文献综述14-33
- 1 海洋微藻14-17
- 1.1 海洋微藻的生态重要性14-15
- 1.2 海洋微藻的应用价值15-16
- 1.3 经典分类学对海洋微藻分类调查的不足16-17
- 2 微藻分类鉴定的分子方法17-25
- 2.1 DNA条形码技术17-25
- 2.2 指纹图谱法25
- 3 微藻群落结构的研究方法25-28
- 3.1 扩增子测序法25-26
- 3.2 rDNA克隆文库法存在的问题26-28
- 4 高通量测序技术(High-throughput sequencing)28-31
- 4.1 高通量测序简介28-29
- 4.2 Miseq测序原理29-30
- 4.3 高通量测序技术在微生物群落结构研究中的应用30-31
- 5 研究目的及意义31-33
- 第二章 海洋微藻DNA条形码基因的评估33-55
- 0 引言33
- 1 实验材料33-36
- 1.1 藻种来源33-34
- 1.2 实验试剂34-35
- 1.3 实验仪器与耗材35-36
- 2 实验方法36-40
- 2.1 硅藻的分离纯化和培养36
- 2.2 硅藻的形态鉴定36
- 2.3 硅藻18S和ITS rDNA、COI及rbcL通用引物的设计36-37
- 2.4 DNA的提取37-38
- 2.5 PCR扩增38
- 2.6 电泳检测、测序38
- 2.7 部分序列的胶回收、克降和测序38-39
- 2.8 序列处理和分析39-40
- 3 实验结果40-52
- 3.1 藻种的鉴定40-42
- 3.2 18S rDNA、ITS rDNA、COI、rbcL及UPA的扩增、测序以及比对42-43
- 3.3 18S rDNA、ITS rDNA、COI、rbcL和UPA的遗传差异43-44
- 3.4 碱基替换饱和性分析44-45
- 3.5 18S、ITS、COI和rbcL的系统发育分析45-52
- 4 讨论52-55
- 4.1 本文设计的引物的通用性52-53
- 4.2 硅藻核内rDNA、线粒体和质体基因的遗传差异53
- 4.3 18S rDNA、ITS rDNA、rbcL和COI作为硅藻DNA条形码的效力53-55
- 第三章 rDNA定量准确性的评估55-65
- 0 引言55
- 1 实验材料55-56
- 1.1 藻种来源55
- 1.2 实验试剂55
- 1.3 实验仪器与耗材55-56
- 2 实验方法56-58
- 2.1 硅藻混合样本的准备56-57
- 2.2 总DNA的提取以及rDNA的PCR扩增、克隆和测序57
- 2.3 构建硅藻ITS的DNA参考库57-58
- 2.4 序列分析58
- 3 实验结果58-62
- 3.1 选定的目标藻株58-59
- 3.2 两组数据产生的OTUs59-60
- 3.3 DD组和CD组的序列组成60-61
- 3.4 DD组和CD组ITS序列在物种内的遗传距离61
- 3.5 两组混合样本中各物种的序列数与细胞数61-62
- 4 讨论62-65
- 第四章 甲藻定量基因的筛选65-78
- 0 引言65-66
- 1 实验材料66
- 1.1 藻种及样本信息66
- 1.2 实验试剂66
- 2 实验方法66-69
- 2.1 设计通用引物66-67
- 2.2 通用引物的验证67
- 2.3 目的基因的筛选67-68
- 2.4 DNA参考库的构建68
- 2.5 甲藻混合样本的制备与相应克隆文库的构建68
- 2.6 克隆文库的序列分析68-69
- 3 实验结果69-75
- 3.1 HSP90、elf2和actin基因通用引物的扩增结果69-72
- 3.2 目的基因DNA参考库的序列分析72-73
- 3.3 甲藻actin基因克隆文库的OTUs计算73-74
- 3.4 各物种的actin序列数与其细胞量的比较74-75
- 4 讨论75-78
- 4.1 Actin与elf2基因的比较75-76
- 4.2 Actin基因的定性和定量比例存在问题76-77
- 4.3 Actin基因与ITS的比较77-78
- 第五章 Miseq测序分析微藻群落的结构组成78-105
- 0 引言78-79
- 1 实验材料79-81
- 1.1 藻种来源79-80
- 1.2 实验试剂80
- 1.3 实验仪器与耗材80-81
- 2 实验方法81-86
- 2.1 样本的设置81-82
- 2.2 总DNA的提取82
- 2.3 全基因组扩增82
- 2.4 PCR扩增和产物的纯化回收82-84
- 2.5 PCR-free文库的构建和上机测序84
- 2.6 Actin基因和18S v9区的DNA参考库的构建84
- 2.7 数据分析84-86
- 2.7.1 序列拼接和质量过滤84-85
- 2.7.2 OTUs分析和物种注释85
- 2.7.3 各样本的物种组成和群落结构分析85
- 2.7.4 样本的多样性分析85-86
- 3 实验结果86-100
- 3.1 7个模拟样品的细胞组成86-87
- 3.2 Actin基因测序结果87-93
- 3.2.1 数据预处理统计和质控信息87-88
- 3.2.2 Actin样本的组成结构88-91
- 3.2.3 Actin样本的多样性91-93
- 3.3 18S v9区测序结果93-100
- 3.3.1 数据预处理统计和质控信息93-94
- 3.3.2 18S v9样本的组成结构94-98
- 3.3.3 18S v9样本的多样性98-100
- 4 讨论100-105
- 4.1 18S v9测序结果分析100-101
- 4.2 Actin基因测序结果分析101-102
- 4.3 18S v9和actin基因测序结果的比较102-103
- 4.4 全基因组扩增样本分析103-105
- 参考文献105-120
- 附录120-122
- 致谢122-123
- 个人简历123
- 发表的学术论文123
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