Hsa-miR-200a调控红细胞分化的功能及分子机制研究

发布时间：2017-09-17 13:28

  本文关键词：Hsa-miR-200a调控红细胞分化的功能及分子机制研究

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【摘要】：人体每天产生约1011个红细胞以满足机体输送氧气和二氧化碳,同时维持酸碱平衡等生理需求。红细胞生成异常将会导致镰刀型贫血症、地中海贫血症等严重危害人类健康的疾病。因此,对红细胞分化调控机制的研究极其重要。大部分红细胞生成于骨髓当中,骨髓中的造血干细胞经一系列分化并产生不同阶段细胞,最终脱核成为成熟红细胞。这一正常生理过程受到细胞微环境、染色质构象和活性、生长因子、转录调控因子、非编码RNA等诸多因素的调控,复杂而精密。MicroRNA(miRNA)是近年来研究较为热门的一类具有调控基因表达功能的非编码RNA。本文通过系统挖掘红细胞不同分化发育阶段红系母细胞的miRNA组学测序数据,探索miRNA调控红细胞分化的分子机制。最终确定7个具有潜在调控红细胞分化功能的miRNA.利用人脐血来源的CD34+造血干细胞体外红系分化.Hemin诱导的K562细胞红系分化、促红细胞生成素(EPO)诱导的TF-1细胞红系分化等细胞生物学实验研究结果,最终确定hsa-miR-200a为我们的研究对象。通过过表达miR-200a,我们发现无论是在红系K562还是在TF-1细胞中,miR-200a都能够抑制多个珠蛋白基因和红系调控因子GATA-1、KLF1的表达。利用EPO对TF-1细胞进行红系分化诱导,发现在红细胞分化过程中过表达miR-200a能够抑制珠蛋白基因表达、CD235a和CD71在细胞表面表达。过表达miR-200a的TF-1细胞在红系分化中血红蛋白浓度增长速率也显著慢于对照细胞。由此证实miR-200a能够抑制红系分化。此外,我们还利用Ion Proton测序平台对过表达niR-200a的TF-1细胞进行了转录组测序研究,功能聚类与调控网络等分析结果均进一步证实了miR-200a对红细胞分化的影响作用。为进一步明确miR-200a调控红细胞分化的分子机制,我们结合转录组数据和miRNA靶基因预测数据库来筛选miR-200a的候选靶基因。最终确定了PDCD4和THRB为miR-200a候选靶基因。通过对这两个候选靶基因表达的检测、双荧光素酶报告系统的分析和RISC-IP实验评估等,最终证实miR-200a靶向PDCD4和THRB的生物学作用。进一步,在K562细胞中对PDCD4和THRB分别进行了过表达和敲低处理,以研究两者的生物学功能。结果表明：过表达PDCD4或THRB能够促进珠蛋白和GATA-1、KLF1基因的表达：而敲低则相反。这一调控结果同miR-200a的调控效应可以相互印证。综上,我们从miRNA组学数据出发,首先明确潜在调控红细胞分化的miRNA。结合不同红系分化研究模型的功能实验与转录组学数据分析,证实了miR-200a具有调控红细胞分化的功能。进一步的机制研究表明,PDCD4和THRB是niR-200a的靶基因,且两者也具有调控红细胞分化的功能。由此,miR-200a可通过靶向PDCD4和THRB调控红细胞分化。
【关键词】：红细胞分化 hsa-miR-200a PDCD4 THRB 转录组测序
【学位授予单位】：中国科学院北京基因组研究所
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q343
【目录】：

• 致谢5-7
• 摘要7-9
• ABSTRACT9-11
• 专业词汇中英文对照11-16
• 第一章 绪论16-36
• 1.1 红细胞分化和发育的概述17-26
• 1.1.1 红细胞分化发育基本过程17-19
• 1.1.2 红细胞分化调控的研究19-25
• 1.1.3 红细胞分化和发育异常引起的疾病及治疗25-26
• 1.2 microRNA调控红细胞分化的研究进展26-29
• 1.2.1 正调控红细胞分化的microRNA27-28
• 1.2.2 负调控红细胞分化的microRNA28
• 1.2.3 microRNA调控红细胞分化的主要研究方法28-29
• 1.3 Hsa-miR-200a的研究进展29-31
• 1.3.1 miR-200a在癌症中的功能研究30-31
• 1.3.2 miR-200a在细胞分化中的功能研究31
• 1.4 PDCD4的研究进展31-32
• 1.4.1 PDCD4在肿瘤中的功能研究31
• 1.4.2 PDCD4在细胞分化中的功能研究31-32
• 1.5 THRB的研究进展32-36
• 1.5.1 TRβ作为核内转录因子32
• 1.5.2 TRβ的生理功能32-36
• 第二章 材料和方法36-56
• 2.1 实验试剂和仪器36-38
• 2.1.1 实验试剂和耗材36-37
• 2.1.2 试剂盒37
• 2.1.3 常用溶液和培养基37-38
• 2.1.4 实验仪器38
• 2.2 质粒38-43
• 2.2.1 用于基因过表达的质粒38-39
• 2.2.2 用于基因敲低的质粒39-40
• 2.2.3 用于双荧光素酶报告检测的质粒40
• 2.2.4 质粒的构建40-42
• 2.2.5 突变型pGL3-CMV-luc-3'UTR质粒的获得42-43
• 2.3 细胞43-48
• 2.3.1 细胞来源43-44
• 2.3.2 细胞复苏、培养及冻存44-45
• 2.3.3 细胞红系分化诱导45-46
• 2.3.4 细胞转染46-47
• 2.3.5 稳定细胞系构建47-48
• 2.4 基因表达的检测48-52
• 2.4.1 miRNA荧光实时定量PCR48-50
• 2.4.2 mRNA荧光实时定量PCR50-51
• 2.4.3 免疫印迹技术(western blot)51-52
• 2.4.4 流式细胞仪分析细胞表面CD235a和CD71表达52
• 2.5 细胞血红蛋白浓度检测52-53
• 2.6 miRNA靶基因鉴定53-54
• 2.6.1 双荧光素酶报告实验53
• 2.6.2 RNA诱导沉默复合体-免疫共沉淀技术(RISC-IP)53-54
• 2.7 高通量测序54-55
• 2.7.1 转录组测序54
• 2.7.2 miRNA组测序54-55
• 2.7.3 数据分析55
• 2.8 统计学分析55-56
• 第三章 结果与讨论56-82
• 3.1 筛选调控红细胞分化的miRNA56-61
• 3.1.1 从HESC到PBER的miRNA数据中筛选候选miRNA56-57
• 3.1.2 候选miRNA在其它红细胞分化研究模型中的表达谱57-61
• 3.2 miR-200a调控红细胞分化61-66
• 3.2.1 K562中过表达miR-200a抑制珠蛋白基因表达61-62
• 3.2.2 TF-1中过表达miR-200a抑制珠蛋白及红系重要基因的表达62-63
• 3.2.3 miR-200a抑制诱导的TF-1红系分化63-66
• 3.3 miR-200a调控TF-1细胞的转录组学研究66-71
• 3.3.1 转录组分析概况66-67
• 3.3.2 转录组功能分析进一步证实miR-200a对红系分化的影响67-71
• 3.4 miR-200a的靶基因筛选71-72
• 3.5 PDCD4是miR-200a的一个靶基因72-75
• 3.5.1 miR-200a抑制PDCD4表达72-73
• 3.5.2 miR-200a能够结合在PDCD4的3'-UTR上73-75
• 3.6 THRB是miR-200a的一个靶基因75-76
• 3.7 miR-200a靶基因的功能研究76-82
• 3.7.1 PDCD4的功能研究76-78
• 3.7.2 THRB的功能研究78-82
• 第四章 结论82-84
• 参考文献84-100
• 附录100-120
• 作者简介及在学期间发表的学术论文与研究成果120-121

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 Weiqi Tan;Yang Li;Seng-Gee Lim;Theresa MC Tan;;miR-106b-25/miR-17-92 clusters: Polycistrons with oncogenic roles in hepatocellular carcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2014年20期

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本文编号：869661