基于代谢组学的中华羊茅-内生真菌共生体响应低温胁迫的生化机制

发布时间：2017-09-24 02:03

  本文关键词：基于代谢组学的中华羊茅-内生真菌共生体响应低温胁迫的生化机制

  更多相关文章： 中华羊茅 内生真菌Epichlo(e|)肠誊 低温胁迫 代谢组学 麦角碱 糖代谢 生物活性

【摘要】：极端温度、干旱、盐碱、病原菌等严重影响植物生产力,中华羊茅(Festuca sinensis)是一种内生真菌侵染率高的多年生草本植物,具有适口性好、营养价值高、抗寒、抗旱、发病率低等优势。本研究以甘肃夏河、青海玉树和海北三种生态型中华羊茅为试验材料,在低温胁迫下,探讨Epichloe或外源钙对内生真菌生物碱、代谢谱和糖代谢的影响；分离Epichloe并粗提其代谢产物,测定生物活性。本文的主要研究结果如下：1.利用高效液相色谱(HPLC)测定麦角碱含量,结果表明麦角酰胺、麦角新碱和总麦角碱含量在短期(7 d)低温胁迫(5℃、10℃)的三种生态型之间存在显著性差异(P0.05)；在5℃时带菌植株(E+)中麦角酰胺、麦角新碱和总麦角碱含量显著高于正常温度下的植株(P0.05)。基于气质联用(GC-MS)的代谢数据,采用主成分分析(PCA)的载荷图表明,一些含氮化合物、酸、糖、醇和未知化合物等24种为分类贡献最大的标志性代谢物,其含量普遍为E+植株中高于E-植株,三种生态型在不同温度环境下代谢谱存在差异性。通过聚类分析,分为三类样品：正常温度下的样品、低温处理后E+样品和低温处理后不带菌植株(E-)样品；不同代谢产物分为两组,一组仅包含8种化合物,另一组包含109种化合物,又划分为三类。研究结果显示,许多代谢产物的变化与植物抗寒性关系密切,为从代谢组学角度筛选抗寒性禾草类牧草品系提供新的思路。2.中华羊茅响应低温胁迫(1±1℃)过程的试验,初步明确了多种目标代谢产物的动态变化。低温胁迫促进三种生态型的多种含氮化合物如谷氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、GABA等含量增加,两种生态型的多种有机酸在低温胁迫期间稍有下降。三种生态型对正常温度和低温胁迫的反应均不同。然而内生真菌能提高与糖酵解、三羧酸循环和氨基酸合成途径的相关代谢物水平,说明内生真菌能增强中华羊茅的抗寒能力。本试验结果为进一步用代谢组学方法阐释植物抗寒性机制奠定基础。3.通过PCA和聚类分析Epichloe XH03菌株低温代谢谱,结果表明温度显著影响代谢产物的变化,分类贡献率最大的标志性代谢物有一些含氮化合物、糖类、有机酸。尸胺、氨基乙醇、亮氨酸、丝氨酸、焦谷氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、氨基丙二酸、苯丙氨酸等含氮物质在低温条件下增加；果糖、葡萄糖等糖类也在低温下积累,而蔗糖含量降低；低温降低一部分有机酸的含量。本结果为更好理解共生体抗寒性提供科学依据。4.田间严寒试验,外源钙和或Epichloe对三种生态型响应低温胁迫时叶片相对含水量(RWC)、叶绿素、根系活力和糖类物质的影响不一致。随胁迫时间的延长,三种生态型中果糖含量为先升后降,根系葡萄糖含量不断增加。在生态型XH中,Epichloe促进胁迫14d和28 d时RWC、胁迫0d时叶绿素、胁迫0d和14d时根系活力、地上部分可溶性糖和葡萄糖以及胁迫28 d时根系蔗糖含量增加；外源钙促进叶绿素、胁迫28 d时根系活力、地上部分和根系可溶性糖、根系果糖和E+植株地上部分果糖含量上升,促使E+植株地上部分蔗糖含量高于对照E-,降低E+植株RWC,但对类胡萝卜素的影响因胁迫时间和Epichloe而异。在生态型HB中,Epichloe提高胁迫0d和14d时RWC、地上部分果糖和葡萄糖含量,降低胁迫14d和28 d时类胡萝卜素含量；外源钙增加胁迫28 d时叶绿素、类胡萝卜素、地上部分和根系可溶性糖、地上部分和根系果糖、根系葡萄糖、E-植株地上部分葡萄糖和胁迫14 d时RWC、E+植株的根系活力和地上部分蔗糖含量,而降低E+植株中RWC, Epichloe和外源钙协同作用时提高根系蔗糖水平。生态型YS中,Epichloe促进胁迫28 d时RWC、根系活力、根系果糖、地上部分和根系可溶性糖的积累,降低胁迫14d时类胡萝卜素含量：外源钙提高胁迫28 d时RWC、胁迫28 d时E-植株叶绿素和类胡萝卜素、E+植株胁迫14d时类胡萝卜素、根系活力、地上部分和根系可溶性糖、E-植株地上部分果糖和葡萄糖含量,以及E-植株胁迫28 d时蔗糖的积累。这些结果表明了外源钙和或内生真菌能增强植物耐寒力。5.平板对峙培养表明Epichloe XH03对植物病原菌链格孢、离蠕孢和新月弯孢的菌丝生长抑制率至少为50%。利用不同溶剂萃取发酵物获得不同的粗提物进行抗菌活性的结果表明：乙酸乙酯粗提物对链格孢、离蠕孢、新月弯孢和镰刀菌菌丝生长表现出良好的抑制活性。在离体叶片上Epichloe显著减少所测试的病原菌感病率及病斑大小；接种病原菌孢子和乙酸乙酯粗提物的混合液或仅接种病原菌孢子悬浮液于离体叶片上,发现两者的病斑大小存在显著性差异。基于GC-MS检测出Epichloe XH03乙酸乙酯粗提物包含多种化学成分。
【关键词】：中华羊茅 内生真菌Epichlo(e|")肠誊 低温胁迫 代谢组学 麦角碱 糖代谢 生物活性
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q948.122.3
【目录】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-8
• 缩写8-15
• 引言15-17
• 第一章 文献综述17-27
• 1.1 植物对低温胁迫的响应17-18
• 1.1.1 水分生理代谢与抗寒性17
• 1.1.2 叶绿素、类胡萝卜素与抗寒性17
• 1.1.3 根系活力与抗寒性17-18
• 1.1.4 渗透调节物质与抗寒性18
• 1.2 外源钙对植物响应低温胁迫的影响18-19
• 1.3 微生物-植物共生体对低温胁迫的响应19-20
• 1.4 植物抗逆性代谢组学研究20-24
• 1.4.1 代谢组学的概念20
• 1.4.2 代谢组学的研究方法20-21
• 1.4.3 温度胁迫21-22
• 1.4.4 干旱胁迫22-23
• 1.4.5 盐胁迫23
• 1.4.6 微生物-植物共生体23-24
• 1.4.7 微生物低温胁迫24
• 1.5 禾草内生真菌及共生体对病原菌拮抗作用24-25
• 1.5.1 离体纯培养条件下禾草内生真菌对病原菌的作用24-25
• 1.5.2 离体叶片条件下禾草内生真菌对病原菌的作用25
• 1.6 中华羊茅的研究现状25-27
• 第二章 Epichloe中华羊茅不同低温胁迫的影响27-57
• 2.1 前言27-28
• 2.2 材料与方法28-30
• 2.2.1 植物材料28
• 2.2.2 建立中华羊茅E+、E-种群及低温处理28-29
• 2.2.3 农艺性状指标测定29
• 2.2.4 生物碱提取及测定29
• 2.2.5 代谢组学样品提取与衍生化方法29-30
• 2.2.6 GC-MS分析及代谢数据比对30
• 2.2.7 统计分析30
• 2.3 结果与分析30-44
• 2.3.1 内生真菌对不同低温胁迫下中华羊茅农艺性状的影响30-34
• 2.3.2 不同低温胁迫下中华羊茅共生体麦角碱的含量34-36
• 2.3.2.1 不同低温胁迫对中华羊茅共生体麦角酰胺含量的影响34
• 2.3.2.2 不同低温胁迫对中华羊茅共生体麦角新碱含量的影响34-35
• 2.3.2.3 不同低温胁迫对中华羊茅共生体总麦角碱含量的影响35
• 2.3.2.4 麦角酰胺与麦角新碱相关性,及总麦角碱与海拔相关性35-36
• 2.3.3 不同低温胁迫下三种生态型的E+、E-代谢物的分析36-44
• 2.3.3.1 主成分分析(PCA)36-40
• 2.3.3.2 聚类分析40-42
• 2.3.3.3 三种生态型在低温条件下氨基酸的变化42-44
• 2.4 讨论44-57
• 2.4.1 不同低温胁迫Epichloe对中华羊茅农艺性状的影响44
• 2.4.2 不同低温胁迫对中华羊茅共生体生物碱含量的影响44-45
• 2.4.3 不同低温胁迫Epichloe对中华羊茅代谢产物的影响45-57
• 第三章 中华羊茅-内生真菌共生体应答低温胁迫过程的代谢谱分析57-86
• 3.1 前言57
• 3.2 材料与方法57-58
• 3.2.1 植物材料57
• 3.2.2 建立中华羊茅E+、E-种群及处理57-58
• 3.2.3 代谢组学样品提取及衍生化方法58
• 3.2.4 GC-MS分析条件及代谢数据比对58
• 3.2.5 统计分析58
• 3.3 结果与分析58-66
• 3.3.1 正常温度下三种生态型代谢产物变化58-59
• 3.3.2 三种生态型在低温条件下氨基酸含量变化59-60
• 3.3.3 三种生态型在低温条件下有机酸含量变化60-61
• 3.3.4 三种生态型在低温条件下碳水化合物和其它化合物的变化61-65
• 3.3.5 三种生态型在低温条件下显著增长的代谢产物数量65-66
• 3.3.6 丙氨酸与谷氨酸的关系66
• 3.4 讨论66-86
• 3.4.1 低温胁迫影响中华羊茅的氨基酸变化66-69
• 3.4.2 低温胁迫影响中华羊茅有机酸含量的变化69
• 3.4.3 低温胁迫影响中华羊茅碳水化合物及其它物质含量的变化69-86
• 第四章 中华羊茅Epichloe响应低温胁迫代谢物的变化86-97
• 4.1 前言86
• 4.2 材料和方法86-88
• 4.2.1 植物材料86
• 4.2.2 内生真菌分离、培养86-87
• 4.2.3 温度对内生真菌生长的影响87
• 4.2.4 代谢物样品的制备和衍生化87
• 4.2.5 GC-MS分析87
• 4.2.6 数据处理与分析87-88
• 4.3 结果与分析88-93
• 4.3.1 温度对Epichloe XH03生长的影响88
• 4.3.2 内生真菌Epichloe XH03在不同低温条件下代谢物的主成分分析88-89
• 4.3.3 内生真菌Epichloe XH03在不同低温条件下代谢物的聚类分析89-90
• 4.3.4 Epichloe XH03在低温条件下标志性代谢产物的变化90-92
• 4.3.5 Epichloe XH03在低温条件下氨基酸的变化92-93
• 4.4 讨论93-97
• 第五章 田间低温下外源Ca~(2+)调控中华羊茅内生真菌共生体生理特性及糖代谢97-125
• 5.1 前言97-98
• 5.2 材料与方法98-101
• 5.2.1 中华羊茅田间抗寒性98
• 5.2.1.1 田间设计98
• 5.2.1.2 测定项目98
• 5.2.2 外源Ca~(2+)对田间中华羊茅生理特性及糖代谢的影响98-101
• 5.2.2.1 田间设计和处理98-99
• 5.2.2.2 叶片相对含水量测定99
• 5.2.2.3 叶绿素和类胡萝卜素测定99-100
• 5.2.2.4 根系活力测定100
• 5.2.2.5 可溶性糖测定100
• 5.2.2.6 蔗糖测定100
• 5.2.2.7 果糖测定100
• 5.2.2.8 葡萄糖测定100-101
• 5.2.3 统计分析101
• 5.3 结果与分析101-121
• 5.3.1 中华羊茅田间抗寒性101
• 5.3.2 外源Ca~(2+)对田间低温胁迫下中华羊茅生理特性及糖代谢的影响101-121
• 5.3.2.1 外源Ca~(2+)对田间低温胁迫下中华羊茅相对含水量的影响101-103
• 5.3.2.2 外源Ca~(2+)对田间低温胁迫下中华羊茅叶绿素和类胡萝卜素的影响103-107
• 5.3.2.3 外源Ca~(2+)对田间低温胁迫下中华羊茅根系活力的影响107-109
• 5.3.2.4 外源Ca~(2+)对田间低温胁迫下中华羊茅可溶性糖的影响109-112
• 5.3.2.5 外源Ca~(2+)对田间低温胁迫下中华羊茅蔗糖的影响112-114
• 5.3.2.6 外源Ca~(2+)对田间低温胁迫下中华羊茅果糖的影响114-117
• 5.3.2.7 外源Ca~(2+)对田间低温胁迫下中华羊茅葡萄糖的影响117-119
• 5.3.2.8 田间低温胁迫下各种糖含量的相关性分析119-121
• 5.4 讨论121-125
• 5.4.1 田间低温胁迫下内生真菌对中华羊茅农艺性状的影响121
• 5.4.2 田间低温胁迫下内生真菌和外源钙对中华羊茅生理特性的影响121-122
• 5.4.3 田间低温胁迫下内生真菌和外源钙对中华羊茅糖积累的影响122-125
• 第六章 中华羊茅Epichloe生物活性的研究125-141
• 6.1 前言125
• 6.2 材料与方法125-128
• 6.2.1 中华羊茅E+和E-种群的建立126
• 6.2.2 菌株126
• 6.2.3 病原菌126
• 6.2.4 培养基126
• 6.2.5 内生真菌培养及粗提物提取126
• 6.2.6 抗菌活性测定126-127
• 6.2.7 离体叶片测定内生真菌或内生真菌和抗菌物质的混合液对病原菌的拮抗作用127
• 6.2.8 活性物质的GC-MS分析条件127-128
• 6.2.9 统计分析128
• 6.3 结果与分析128-135
• 6.3.1 离体叶片E+和E-对病原菌的拮抗作用128-131
• 6.3.2 平板对峙培养内生真菌与病原菌拮抗作用131-132
• 6.3.3 代谢物质的粗提物对病原菌的拮抗作用132-134
• 6.3.4 离体叶片上抑菌物质对病原菌的拮抗作用134
• 6.3.5 活性物质的化学组成134-135
• 6.4 讨论135-141
• 第七章 全文结论141-143
• 7.1 研究小结141
• 7.2 创新之处141-142
• 7.3 研究展望142-143
• 参考文献143-167
• 在学期间的研究成果167-168
• 在学期间参与的科研项目168-169
• 致谢169

【参考文献】

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本文编号：908710