Bradyrhizobium diazoefficiens 4534和4222菌株选择性结瘤的分子生物学机理比较研究

发布时间：2017-09-28 13:13

  本文关键词：Bradyrhizobium diazoefficiens 4534和4222菌株选择性结瘤的分子生物学机理比较研究

  更多相关文章： 大豆根瘤菌 选择性结瘤 结瘤能力 基因组学 蛋白质组学 转录组学

【摘要】：根瘤菌选择性结瘤的分子机理是长期关注的热点,也是制约根瘤菌发挥固氮应用潜能的关键所在。多年的研究使我们初步掌握了根瘤菌选择性结瘤的基本过程及其影响因子,并获得了多个与根瘤菌共生、固氮和选择性结瘤相关的基因。但是对根瘤菌株基因之间的相互联系、菌株基因的遗传、调控和表达差异以及基因与宿主的相互作用等方面缺乏全面系统的了解。本研究以与大豆品种中黄13存在结瘤能力显著差异的Bradyrhizobium diazoefficiens的两株菌为材料,在比较基因组学的基础上,采用比较蛋白质组学和转录组学方法进行了大豆根系分泌物处理下的蛋白表达和基因表达差异分析,以进一步揭示根瘤菌的选择性结瘤机理及其主要影响因子。本研究取得主要结果如下：1.本研究设计并改进了一种高效促进大豆结瘤的大豆根系分泌物的制备方法。根瘤菌诱导试验的难点之一就是如何获得有效的大豆根际分泌诱导物,这是保证后续研究结果准确、可靠的关键因素。经过反复试验设计、改进并最终获得了一种高效促进大豆结瘤的大豆根系分泌物的制备方法,提高了分泌物的收集提取效率。应用上述所建立的技术方法成功收集了中黄13的根系分泌物,经其诱导后菌株的蛋白质组和转录组分析结果证明,所建立根系分泌物制备可行高效。2.完成了B. diazoefficiens 4534和B. diazoefficiens 4222基因组测序,初步了解了它们的基因组特性。基因组分析表明它们均由一个单复制子构成,染色体上各含有三个核糖体操纵子,G+C含量分别为65.0%和64.9%,基因的平均长度分别为903 bp和901 bp,分别预测出8072个和8233个ORF；但两基因组中均有近一半未知功能的ORF,为系统分析根瘤菌基因信息带了一定困难：分析发现两菌株间在直系统同源基因上有大量差异,这可能与结瘤差异等过程相关。3.首次从比较基因组层面较深入系统揭示了大豆根瘤菌B. diazoefficiens 4534B.diazoefficiens 4222选择性结瘤能力差异的可能分子差别。比较分析基因组发现这两菌株间存在大量差异直系统同源基因,显示它们选择性结瘤能力差异的可能分子差别,主要涉及脯氨酸代谢、甘露醇、磷酸盐和钼转运蛋白、群集效应和IAA谢等过程。这可能是含有更多功能基因的B.diazoefficiens 4534菌株具有更高的选择性结瘤能力的潜在原因。4.较全面开展了大豆根瘤菌B. diazoefficiens 4534和5. diazoefficiens 4222选择性结瘤分子机理的蛋白质组学分析,结果表明：在大豆根系分泌物的处理下,菌株4534有65个差异表达蛋白,菌株4222有29个差异表达蛋白。与菌株4222相比,菌株4534产生更多种类和数量上的差异蛋白；差异蛋白的分析推断,可能是S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)、PhyR-σEcfG调节子、ABC转运蛋白、鞭毛蛋白、分子伴侣、与氧化还原状态维持相关的蛋以及一些未知蛋白使得B.diazoefficiens4534具有更高的选择性结瘤能力；大豆根系分泌物的作用不仅局限于对大豆根瘤菌结瘤基因表达的诱导,还与新陈代谢和环境适应相关的蛋白／酶的表达正相关。5.完成了B. diazoefficiens 4534和5. diazoefficiens 4222转录组分析,结果表明：在根系分泌物的诱导下菌株4534有457个显著差异表达基因,其中上调基因253个,下调基因204个。而菌株4222只有293个显著差异表达基因,其中上调基因108个,下调基因185个；两菌株差异表达基因的GO功能富集分类、代谢途径分析和KEGG富集分析结果显示,在根系分泌物的诱导下,菌株4534中与鞭毛合成、信号刺激和趋性相关的基因表达差异显著,菌株4222中只有与鞭毛合成相关的基因表达差异显著。
【关键词】：大豆根瘤菌 选择性结瘤 结瘤能力 基因组学 蛋白质组学 转录组学
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q939.114
【目录】：

• 附件5-6
• 摘要6-7
• Abstract7-16
• 英文缩略表16-17
• 第一章 绪论17-35
• 1.1 根瘤菌选择性结瘤的意义17
• 1.2 根瘤菌选择性结瘤的分子基础17-22
• 1.2.1 选择性结瘤的概念17-18
• 1.2.2 选择性结瘤的过程18-19
• 1.2.3 结瘤信号的感知19-22
• 1.2.4 根瘤菌结瘤诱导物质的研究22
• 1.3 根瘤菌选择性结瘤的影响因素研究进展22-25
• 1.3.1 根瘤菌基因型对选择性结瘤能力的影响23-25
• 1.3.2 植物基因型对根瘤菌竞争结瘤能力的影响25
• 1.3.3 环境因素25
• 1.4 根瘤菌基因组学、蛋白质组学和转录组学研究进展25-32
• 1.4.1 根瘤菌基因组学研究进展26-28
• 1.4.2 根瘤菌蛋白质组学研究进展28-30
• 1.4.3 根瘤菌转录组学研究进展30-32
• 1.5 选题目的和意义32-34
• 1.6 本研究的技术路线34-35
• 第二章 Bradyrhizobium diazoefficiens选择性结瘤验证及有效根系分泌物提取35-47
• 2.1 材料与方法35-39
• 2.1.1 试验材料35
• 2.1.2 仪器与试剂35-36
• 2.1.3 大豆根瘤菌验证试验36-37
• 2.1.4 菌株的分离、纯化和保存37
• 2.1.5 总DNA的提取37
• 2.1.6 BOX-PCR37-38
• 2.1.7 大豆根系分泌物的收集38
• 2.1.8 大豆根系分泌物有效性评价38-39
• 2.2 结果与分析39-46
• 2.2.1 大豆根瘤菌株验证试验39-40
• 2.2.2 总DNA的提取40-41
• 2.2.3 BOX-PCR结果41
• 2.2.4 大豆根系分泌物收集装置41-42
• 2.2.5 nod基因的诱导42-46
• 2.3 讨论46-47
• 第三章 Bradyrhizobium diazoefficiens选择性结瘤分子机理的比较基因组学分析47-62
• 3.1 试验材料和方法47-49
• 3.1.1 菌株47
• 3.1.2 基因组DNA的提取47
• 3.1.3 根瘤菌基因组序列的测定47-48
• 3.1.4 基因组的注释与分析48-49
• 3.2 结果和分析49-61
• 3.2.1 基因组组装49
• 3.2.2 原始数据质控49-51
• 3.2.3 基因组组装结果51-52
• 3.2.4 基因组预测结果52-53
• 3.2.5 RNA的预测与分析53-54
• 3.2.6 基因功能注释与比较54-57
• 3.2.7 基因组系统发育分析57-58
• 3.2.8 直系同源分析58-59
• 3.2.9 两根瘤菌基因组差异分析59-61
• 3.3 讨论61-62
• 第四章 Bradyrhizobium diazoefficiens选择性结瘤分子机理的蛋白质组学分析62-77
• 4.1 试验材料62
• 4.2 试验方法62-67
• 4.2.1 主要仪器设备62-63
• 4.2.2 主要试剂及配制63-65
• 4.2.3 根瘤菌生长曲线的测定65
• 4.2.4 根系分泌物对根瘤菌的诱导65-66
• 4.2.5 根瘤菌蛋白的提取66
• 4.2.6 蛋白质双向电泳和染色66
• 4.2.7 蛋白质凝胶图像分析66
• 4.2.8 差异蛋白的质谱分析和鉴定66-67
• 4.3 结果与分析67-75
• 4.3.1 根瘤菌生长曲线测定67
• 4.3.2 根瘤菌蛋白质表达图谱分析67-70
• 4.3.3 大豆根系分泌物诱导的根瘤菌差异蛋白的质谱鉴定70-73
• 4.3.4 两根瘤菌经大豆根系分泌物诱导后差异蛋白的比较73-75
• 4.4 讨论75-77
• 第五章 Bradyrhizobium diazoefficiens选择性结瘤分子机理的转录组学分析77-94
• 5.1 试验材料77
• 5.2 试验方法77-79
• 5.2.1 大豆根系分泌物的收集77
• 5.2.2 菌体的培养和诱导77
• 5.2.3 总RNA的提取77
• 5.2.4 RNA质量检测77
• 5.2.5 转录组文库的构建和测序77-78
• 5.2.6 与测序基因组比对78
• 5.2.7 转录组表达差异分析78
• 5.2.8 基因组的注释与分析78-79
• 5.3 结果和分析79-92
• 5.3.1 根系分泌物对根瘤菌的诱导79
• 5.3.2 根瘤菌RNA的提取79-80
• 5.3.3 转录组数据质控80-81
• 5.3.4 与基因组数据比对81
• 5.3.5 根瘤菌表达差异分析81-82
• 5.3.6 差异基因表达模式聚类82-83
• 5.3.7 差异基因功能注释与比较83-88
• 5.3.8 两根瘤菌基因表达差异分析88-92
• 5.4 讨论92-94
• 第六章 全文结论和展望94-97
• 6.1 全文结论94-95
• 6.2 展望95-97
• 参考文献97-113
• 致谢113-114
• 作者简历114

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 肖文丽;关大伟;李俊;曹凤明;陈慧君;;采用gfp和rfp基因标记评价大豆根瘤菌竞争结瘤能力[J];大豆科学;2010年03期

2 ;Analysis of Two Bradyrhizobium japonicum Strains with Different Symbiotic Matching for Nodulation by Primary Proteomic[J];Journal of Integrative Agriculture;2012年08期

，

本文编号：936028