丹参不同提取部位保护高糖损伤内皮祖细胞的活性及质量控制研究

发布时间：2017-04-08 05:18

  本文关键词：丹参不同提取部位保护高糖损伤内皮祖细胞的活性及质量控制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:本论文通过对丹参不同提取部保护高浓度葡萄糖损伤的内皮祖细胞的活性部位进行筛选,并探讨活性部位的保护作用与NO/e NOS信号通路间的关系,同时对活性组分进行了质量控制研究,以期为以后丹参制药工艺的改进以及临床疗效的提高提供实验基础。方法:取丹参药材粗粉,用6倍量90%的乙醇进行回流提取,得到丹参的乙醇总提取液,再浓缩至1.5g生药/ml,再分别用pet、CHCl3、CH2COOCH2CH3、Bu OH及H2O进行萃取。最后,将药物残渣加7倍量的水煎煮。减压回收各萃取部位的溶剂,真空干燥,得pet、CHCl3、CH2COOCH2CH3、Bu OH、H2O部位及药渣水煎液部位。细胞模型的建立:将诱导培养的内皮祖细胞培养于含60 mmol·L-1葡萄糖溶液的M199培养液中,建立模型细胞。将体外培养的内皮祖细胞分为正常组、高浓度葡萄糖损伤组、渗透压对照组以及各部位丹参提取物组,其中正常组细胞:培养液含有5.5 mmol·L-1的葡萄糖(D-glucose);模型组细胞:培养液含有60 mmol·L-1的葡萄糖(D-glucose);渗透压对照组:培养液中含有5.5 mmol·L-1的葡萄糖(D-glucose)和55.5 mmol·L-1的甘露醇(D-mannitol)。利用MTT法筛选出受试药物对内皮祖细胞增殖能力的影响,以确定最佳受试药物活性部位及其作用浓度。采用酶联免疫(ELISA)法对各组内皮祖细胞中的NO、e NOS的含量进行检测;采用免疫荧光标记检测细胞内e NOS和p-e NOS的分布情况。对保护高浓度葡萄糖损伤的内皮祖细胞活性最佳部位中的有效成分进行薄层色谱鉴别、并且利用高效液相(HPLC)对SM3及SM6部位进行定量鉴别并建立SM3及SM6的指纹图谱。结果:MTT实验结果表明,乙酸乙酯部位(SM3)对高浓度葡萄糖损伤的内皮祖细胞的在所有6各组分中保护作用最佳。此外,药渣水煎液部位(SM6)亦表现出较好的活性作用,且这两个活性两部位的最低有效浓度均是10μg·m L-1。ELISA试剂盒测试结果表明,相比于高浓度葡萄糖处理后的内皮祖细胞中NO以及e NOS的含量显著降低(p均0.05),经丹参活性组分(SM3和SM6)处理后,细胞中NO以及e NOS的含量相比于高糖处理组得到了显著地升高(p均0.05)。免疫荧光结果表明:e NOS蛋白在各组细胞中的分布情况大致相同,主要是集中分布在细胞膜上以及细胞质中,各组相比并无显著差异。p-e NOS蛋白在各组细胞中的分布情况有所差异,正常组中p-e NOS蛋白的表达既出现在细胞膜上,同时也出现在细胞核中,经高糖损伤后,包括高糖损伤模型组以及SM3和SM6组分处理组,p-e NOS主要分布在细胞核中。对SM3及SM6进行了薄层色谱鉴别,并分别对10批SM3和SM6部位进行了定量分析,同时分别建立了指纹图谱,结果表明SM3和SM6部位中均检测到丹参素钠和丹酚酸B两种有效物质,并得出丹参素钠在10批丹参乙酸乙酯部位(SM3)中的平均含量(每1 mg提取物中所含的质量)为9.283μg·mg-1;在药渣水煎液(SM6)中的平均含量(每1 mg提取物中所含的质量)为10.849μg·mg-1;丹酚酸B在乙酸乙酯部位(SM3)的平均含量(每1 mg提取物中所含的质量)为27.344μg·mg-1;在药渣水煎液部位的平均含量(每1 mg提取物中所含的质量)为9.674μg·mg-1。10批乙酸乙酯部位(SM3)通过色谱图的比对确定了28个共有峰。对10批乙酸乙酯部位(SM3)的相似度进行评价,结果表明,与对照相比,S1-S10的相似度均大于0.940,其中S5-S10的相似度超过0.990,10批药渣水煎液部位(SM6)对比色谱图确定共有峰为20个。对10批药渣水煎液部位(SM6)的相似度进行评价,结果显示,与对照相比,S1-S10的相似度均大于0.950。结论:乙酸乙酯部位(SM3)对于高糖损伤的内皮祖细胞的保护作用是最为显著的,药渣水煎液同样具有良好的活性作用,SM3以及SM6发挥保护作用的机制可能与活性部位可以调节细胞中的NO/e NOS信号通路具有一定的关联性。本论文还对SM3和SM6这两个活性部位的提取方法进行了质量控制研究。说明SM3和SM6不仅具有生物学活性,同时其质量可控稳定,为今后制药工艺的改进、临床疗效的提高提供了实验基础。
【关键词】：丹参 内皮祖细胞(EPC) 保护作用 NO/eNOS 质量控制
【学位授予单位】：山东中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R284;R285
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 引言10-12
• 第一部分 综述12-19
• 1 丹参化学成分的研究12-13
• 2 丹参提取方法的研究13-14
• 3 丹参指纹图谱的研究14-15
• 4 丹参的药理作用及相关作用机制15-18
• 5 小结18-19
• 第二部分 丹参不同部位提取物保护高糖损伤内皮祖细胞的活性研究19-35
• 1 实验材料19-21
• 2 实验方法21-26
• 3 实验结果26-33
• 4 结论与讨论33-35
• 第三部分 丹参保护高糖损伤内皮祖细胞活性部位的质量控制研究35-73
• 第一章 丹参保护高糖损伤内皮祖细胞活性部位的化学成分薄层鉴别35-38
• 1 仪器与试药35-36
• 2 实验方法与结果36-37
• 3 小结与讨论37-38
• 第二章 丹参保护高糖损伤内皮祖细胞活性部位中化学成分含量测定38-51
• 1 丹参素钠的含量测定38-44
• 2 丹酚酸B的含量测定44-50
• 3 小结与讨论50-51
• 第三章 丹参保护高糖损伤内皮祖细胞活性部位的高效液相指纹图谱研究51-73
• 1 乙酸乙酯部位（SM3）指纹图谱的建立51-63
• 2 药渣水煎液部位（SM6）指纹图谱的建立63-73
• 结语73-74
• 参考文献74-80
• 致谢80-81
• 论文著作81-93
• 详细摘要93-98

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本文编号：292152