叶酸修饰川芎嗪纳米粒体内外靶向特征及增强肿瘤转移抑制作用研究

发布时间：2017-05-22 18:36

  本文关键词：叶酸修饰川芎嗪纳米粒体内外靶向特征及增强肿瘤转移抑制作用研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:优化叶酸壳聚糖川芎嗪纳米粒(主动靶向纳米粒,FA-CS-LZ-NPs)的制备工艺,考察其体内外靶向特征,探讨其抑制肿瘤转移作用与机制。方法:1.主动靶向纳米粒制备和处方、工艺优化。离子交联法制备主动靶向纳米粒,选取叶酸壳聚糖(FA-CS)浓度、多聚磷酸钠(TPP)浓度、p H值为主要影响因素,以包封率、载药量、粒径作为评价指标,采用Box-Behnken实验设计对纳米粒处方和工艺进行优化。2.主动靶向纳米粒体外靶向性考察。Western Blotting法检测细胞叶酸受体表达水平,筛选细胞用于下一步试验。MTT法检测主动靶向纳米粒的细胞毒性,确定给药剂量。取Bel7402细胞(叶酸受体高表达)分别给予主动靶向纳米粒(FA-CS-LZ-NPs)、被动纳米粒(CS-LZ-NPs)和川芎嗪溶液(LZ),另取L-02(叶酸受体低表达)给予FA-CS-LZ-NPs,HPLC法检测不同时间内细胞对LZ的摄取。FA-CS-LZ-NPs作用于三种叶酸受体表达水平不同的细胞,4h后,HPLC法检测各组细胞内LZ的浓度。3.主动靶向纳米粒体内靶向性考察。异硫氰酸荧光素(FITC)标记FA-CS,红外光谱、核磁共振光谱分析产物的结构表征。荧光素标记主动纳米粒(FITC-FA-CS-NPs)和被动纳米粒(FITC-CS-NPs),H22荷瘤小鼠尾静脉分别注射上述两种标记药物和FITC溶液后,于30min后活体荧光成像,随即小鼠离体组织荧光成像。另取,H22荷瘤小鼠分别尾静脉给予FA-CS-LZ-NPs、CS-LZ-NPs和LZ,HPLC法分析在不同时间点小鼠血浆与组织内川芎嗪药物浓度。4.主动靶向纳米粒抑制肿瘤转移的研究。建立小鼠H22肿瘤转移模型,随机分为8组,分别给予:FA-CS-LZ-NPs(40mg/kg,高剂量)、(20mg/kg,中剂量)、(10mg/kg,低剂量),CS-LZ-NPs(20mg/kg),LZ(20mg/kg),主动空纳米粒(FA-CS-NPs),5-FU(20mg/kg),生理盐水(0.2m L)。连续给药21天,比较各组小鼠体重变化,免疫组织化学检测移植瘤中MMP-9、VEGF的蛋白表达水平,比较各组小鼠肺转移结节数。结果:1.按照优化处方(1mg/m L FA-CS,0.89mg/m L TPP,p H4.61)制备FA-CS-LZ-NPs,该纳米粒的包封率为(36.72±0.65)%,载药量为(9.44±0.17)%,粒径为141.1±0.6 nm,分散度(PDI)为0.219±0.011,Zeta电位为20.8±1.4 mv,可知实验观察值和模型预测值都比较接近,模型预测性良好。2.Western Boltting测得Bel7402、L-02细胞叶酸表达水平具有显著性差异,可用于后续试验。主动靶向纳米粒对Bel7402、L-02细胞的无毒剂量是LZ 47.5μg·m L-1。Bel7402和L-02细胞给药4h后,胞内川芎嗪浓度达到饱和,而且FA-CS-LZ-NPs组Bel7402细胞内LZ药物浓度显著高于CS-LZ-NPs组、LZ溶液组以及L-02细胞FA-CS-LZ-NPs组。说明叶酸修饰的纳米粒促进了Bel7402对药物的摄取。Hela、Bel7402、L-02三种细胞分别给予FA-CS-LZ-NPs处理,经HPLC检测细胞内川芎嗪浓度由高到低依次为HelaBel7402L-02,证明细胞内药物摄取量与细胞叶酸受体表达水平成正相关。3.FITC-FA-CS与FA-CS相比,红外图谱中,在1575cm-1处弯曲振动增强,是壳聚糖的氨基与FITC的异硫氰根反应的结果;核磁氢谱图中,δ6.715,δ6.949ppm处新增两个位移值,为FITC芳烃质子峰,证明FITC偶联到叶酸壳聚糖骨架上。活体成像观察发现,与注射FITC-CS-NPs和FITC溶液相比,注射FITC-FA-CS-NPs荷瘤小鼠肿瘤部位的荧光强度要强。离体脏器成像和体内LZ药物分布结果显示,主动纳米粒组在肿瘤组织的分布显著高于被动纳米粒组、溶液组。经过叶酸修饰的纳米粒主要集中在肿瘤、肝、肾部位,而未经叶酸修饰的纳米粒主要集中在肝、肺部位,溶液组中组织分布较少。4.5-FU组小鼠体重呈下降趋势,其他给药组均有不同程度增长,表明川芎嗪纳米粒毒副作用小。MMP-9、VEGF蛋白表达水平呈剂量依赖性下调,且主动靶向纳米粒抑制效果较好。FA-CS-LZ-NPs与CS-LZ-NPs、LZ溶液相比,抑制肺部转移瘤效果更好,呈剂量依赖性。结论:本实验优化制备出的叶酸壳聚糖川芎嗪纳米粒粒径较小,包封率和载药量较高。体外实验表明此制剂对叶酸受体高表达的Bel7402细胞具有靶向性。体内实验表明该制剂对叶酸受体高表达的H22肿瘤模型靶向效果良好。与被动纳米粒组、川芎嗪溶液组相比较,主动靶向纳米粒对H22转移模型具有更好的抑制肿瘤转移作用,这一作用可能是通过下调MMP-9、VEGF表达水平实现的。
【关键词】：纳米粒 川芎嗪 制备优化 靶向性 抑制转移
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R943
【目录】：

• 中文摘要8-11
• 英文摘要11-15
• 前言15-16
• 材料和方法16-22
• 一、实验材料16-17
• 1 仪器16
• 2 药品与试剂16-17
• 3 细胞株与动物17
• 二、方法17-22
• 1 主动靶向纳米粒制备和处方工艺优化17-19
• 1.1 主动靶向纳米粒的制备17
• 1.2 包封率和载药量的测定17-18
• 1.3 粒径、Zeta电位的检测18
• 1.4 效应面法优化处方设计18-19
• 2 主动靶向纳米粒靶向性考察19-21
• 2.1 体外细胞实验19-20
• 2.2 动物实验20-21
• 3 主动靶向纳米粒抑制肿瘤转移作用的研究21-22
• 3.1 建立肿瘤转移模型21
• 3.2 分组给药及处理21
• 3.3 免疫组织化学21-22
• 4 统计学处理22
• 结果22-39
• 1. 主动靶向纳米粒制备和处方工艺优化22-28
• 1.1 HPLC方法专属性及川芎嗪标准曲线22-23
• 1.2 精密度和回收率23
• 1.3 Box-Behnken实验设计优化结果23-28
• 1.4 FA-CS-LZ-NPs粒径分析及Zeta电位28
• 2. 主动靶向纳米粒体外靶向性考察28-31
• 2.1 细胞叶酸受体表达情况28-29
• 2.2 主动靶向纳米粒的细胞毒性29-30
• 2.3 HPLC检测细胞内川芎嗪的摄取30
• 2.4 主动靶向纳米粒的叶酸受体依赖靶向性30-31
• 3. 主动靶向纳米粒的体内靶向性考察31-36
• 3.1 FITC-FA-CS的结构表征31-32
• 3.2 FITC-FA-CS-Nps活体成像32-33
• 3.3 主动靶向纳米粒体内分布33-36
• 4. 川芎嗪主动靶向纳米粒抑制肿瘤转移作用的研究36-39
• 4.1 FA-CS-LZ-NPs对H22转移模型体重的影响36
• 4.2 肿瘤原发灶MMP和VEGF表达变化36-38
• 4.3 对肺部转移瘤的影响38-39
• 讨论39-41
• 结论41-42
• 参考文献42-46
• 综述46-56
• 参考文献52-56
• 致谢56-57

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