《中国农业大学》2015年博士论文

发布时间：2016-11-03 13:01

  本文关键词：奶牛乳房炎大肠杆菌F17A-MF59疫苗免疫学特性研究，，由笔耕文化传播整理发布。

《中国农业大学》 2015年

奶牛乳房炎大肠杆菌F17A-MF59疫苗免疫学特性研究

刘永夏  

【摘要】：大肠杆菌(E. coli)是奶牛乳房炎(bovine mastitis)最主要的环境致病菌,给奶牛养殖业造成了巨大的经济损失。本研究首先对北京及周边地区的奶牛乳房炎大肠杆菌进行了流行病学调查,细菌分离鉴定结果显示,2012年9月-2013年10月从北京、河北和天津的6个规模化奶牛场采集的663份奶牛乳房炎样本中,分离出大肠杆菌70株,流行率为10.6%。大肠杆菌引发的奶牛乳房炎是通过自身的粘附性菌毛定植在奶牛乳腺上皮细胞,在奶牛乳腺内大量繁殖,继而产生多种毒素导致乳腺组织的炎症。为进一步分析乳房炎源性大肠杆菌的流行特征,根据文献报道通过PCR的方法对分离的大肠杆菌进行了种系分群,毒力因子检测和耐药性分析。结果显示,奶牛乳房炎源性大肠杆菌主要种系进化群为B1群(58.6%)和A群(35.7%),流行的主要毒力基因为f17A(15.7%),irp2(14.3%),astA (10.0%), iucD (7.1%)和colV (5.7%),而且B1群大肠杆菌比A群毒力因子分布更加广泛；大多数分离的大肠杆菌(87.1%)具有耐药性,耐药性最强的是链霉素、卡那霉素和氨苄西林,而且B1群大肠杆菌比A群耐药性要强,其中链霉素耐药表型与基因型具有一致性。 先前的报道和前期对大肠杆菌毒力因子的调查结果均显示,F17菌毛是乳房炎源性大肠杆菌的优势菌毛,所以本研究拟通过制备F17菌毛亚单位疫苗对大肠杆菌性奶牛乳房炎进行防控。在本研究中,首先以分离的大肠杆菌E-BJ-1菌株为模板,通过PCR方法扩增了f17A基因,将该基因与pET28a载体连接构建了f17A-pET28a原核表达载体,经测序验证后转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)制备了F17A蛋白原核表达菌株；对重组菌株经1mM IPTG诱导后,F17A蛋白表达明显增强,随着诱导时间的延长,表达量逐渐增加,在诱导4h后己达到较高水平,SDS-PAGE分析F17A蛋白主要以包涵体的形式存在；随后对诱导菌体进行超声破碎裂解,以包涵体溶解液溶解目的蛋白,利用重组蛋白的His标签对其进行了亲和层析纯化,经蛋白复性处理后,获得了高质量的F17A重组蛋白。 随后,将F17A重组蛋白作为抗原,MF59作为佐剂,制备了F17A-MF59亚单位疫苗,并对疫苗的免疫学特性进行了评价。安全性试验结果显示,疫苗免疫后小鼠精神、食欲均未出现异常,剖检小鼠内脏器官完好,未出现异常病理变化,说明该疫苗的安全性良好；免疫原性分析结果显示,疫苗免疫后小鼠对于F17A蛋白的特异性抗体水平明显高于无佐剂组,而且持续时间更长,抗体亚类以IgG1和IgG2a为主,说明MF59佐剂不仅能有效增强机体的体液免疫,对于Thl型细胞介导的细胞免疫也有较强的促进作用；存活率试验结果显示,疫苗免疫后小鼠攻毒的存活率要显著高于未免疫组,而且恢复正常所需时间更短；主要组织器官载菌量和组织病理学分析结果显示,F17A-MF59疫苗免疫组小鼠的主要内脏器官(肝脏、脾脏、肾脏)在时间和细菌残留数量上对大肠杆菌的清除效率要显著高于未免疫组,特别是肝脏和脾脏,而且F17A-MF59疫苗免疫攻毒组小鼠的病理损伤程度比未免疫攻毒组小鼠有所降低；T淋巴细胞亚群分析结果显示,与正常组相比,未免疫攻毒组CD4+和CD8+T细胞比例均出现显著降低,F17A-MF59免疫攻毒组小鼠CD4+T细胞比例出现显著升高,说明MF59能显著增强机体的体液免疫反应,但CD8+T细胞比例发生了显著的降低(降低幅度低于未免疫组)这可能由于攻毒后小鼠由于细菌的感染,机体的免疫机能受损,或者大肠杆菌主要是胞外致病菌,细胞免疫机能受到抑制所致。总的看来,F17A-MF59疫苗能有效增强机体对于大肠杆菌的抗感染免疫反应,尤其是体液免疫,对于大肠杆菌感染具有良好的免疫保护效果,该研究证实F17A-MF59疫苗具有一定的应用价值,为进一步研究奶牛乳房炎相关疫苗提供了理论依据和实践基础。

【关键词】：
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.61
【目录】：

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