Myostatin基因编辑梅山猪的制备与表型分析

发布时间：2021-08-05 16:44

Myostatin (MSTN)是肌肉生长发育的关键抑制因子。牛、羊、狗和人的MSTN基因突变后会表现出肌肉肥大的现象,又称双肌(DM)表型,然而到目前为止未见有关猪MSTN突变与明显肌肉表型的报道。猪不仅是肉产品的重要来源,而且也是人类疾病研究的理想动物模型。为了研究MSTN突变对猪骨骼肌发育的影响,我们利用无标记基因的锌指核酸酶技术(zFN)结合体细胞克隆技术成功制备并获得了MSTN基因编辑梅山猪。我们首先通过分离培养获得梅山猪的原代胎儿成纤维细胞,利用核转染方法将MSTN的特异ZFN质粒转染到原代胎儿成纤维细胞中。培养24小时后,收集细胞并提取总DNA,利用PCR扩增打靶区域的核酸序列进行TA克隆测序用于检测打靶效率；随机挑取了1000个单菌落进行菌落PCR测序,共鉴定出40个MSTN突变序列,由此判定该ZFN质粒在梅山猪胎儿成纤维细胞中的打靶效率约为4%。随后,利用上述方法转染细胞后,在没有任何药物筛选标记的情况下我们通过有限稀释法获取单细胞克隆。整个实验中共收集并鉴定了约1800个单细胞克隆,获得80个MSTN基因突变的细胞克隆,其中78个为单等位基因突变(MSTN+/+),2个为双等位基因突变(MSTN-/-),所有突变中有超过90%的突变为小于20bp的短片段缺失或插入。从中挑选了14个单细胞克隆用于体细胞克隆实验,经徒手克隆获得2631枚重构胚用于胚胎移植,共移植28头受体母猪,其中有10头母猪怀孕,7头正常生产,共获得19头活仔；最终有8头来自105细胞系、1头来自110细胞系的MSTN基因编辑克隆猪存活并繁育后代。最初获得的MSTN基因编辑克隆猪为MSTN单等位基因突变型(MSTN+/-),经过两次自然交配获得MSTN纯合子突变(MSTN-/-)梅山猪。通过对后代个体的MSTN基因靶位点区域的测序分析证明经ZFN编辑后的基因突变可稳定遗传给后代,并且符合孟德尔遗传定律。同时,我们利用荧光定量PCR、Western blot及ELISA等方法对F2代三种基因型梅山猪MSTN基因的转录及表达情况进行了检测,结果显示MSTN梅山猪骨骼肌中的MSTN基因转录后发生错误拼接无法获得有功能的myostatin蛋白。通过对克隆猪及其后代的观察和屠宰检测发现,MSTN基因编辑猪生长发育正常,与MSTN梅山猪相比其胴体的肌肉量明显增多(MSTN-/-:p0.01;MSTN+/-:p0.05)、脂肪量则明显减少(MSTN-/-:p0.001; MSTN+/-:p0.05);而且MSTN-/-梅山猪表现出明显的双肌型,8月龄MSTN-/-个体的瘦肉率比野生型梅山猪高出11.62%,个别肌肉块的重量由于肌纤维的增多可达到野生对照猪的两倍。除此之外,在本研究中我们还发现约有20%的MSTN-编辑梅山猪表现多—个胸椎的现象。MSTN基因编辑猪的成功制备不仅为提高国内地方脂肪型猪的瘦肉率提供了一种快速的遗传改良方法,而且该基因编辑猪有望成为肌骨系统形成、发育及其相关疾病研究的理想的大动物模型。
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S828;Q78

文章目录

摘要

Abstract

中英文缩略词表

第一章引言

1.1 Myostatin的研究进展

1.1.1 Myostatin基因的发现与分子特点

1.1.2 Myostatin的表达与调控

1.1.3 Myostatin的生物学功能

1.1.4 Myostatin的应用

1.2 锌指核酸酶技术简介

1.3 梅山猪的种质特性及应用

1.4 研究意义和目标

第二章 MSTN基因编辑梅山猪的制备

2.1 材料与方法

2.1.1 试验动物

2.1.2 仪器与试剂

2.1.3 锌指核酸酶的设计与合成

2.1.4 胎儿成纤维细胞的分离培养

2.1.5 细胞转染实验

2.1.6 锌指核酸酶打靶效率检测

2.1.7 单细胞克隆的培养与基因型鉴定

2.1.8 猪体细胞克隆

2.1.9 ZFN脱靶及载体片段整合分析

2.2 结果与分析

2.2.1 锌指核酸酶质粒的设计与合成

2.2.2 梅山猪胎儿成纤维细胞的获得

2.2.3 锌指核酸酶质粒转染效率及打靶效率检测

2.2.4 MSTN基因编辑单细胞克隆的筛选

2.2.5 MSTN基因编辑梅山猪的成功制备与繁育

2.2.6 ZFN脱靶及载体片段整合分析结果

第三章 MSTN基因编辑梅山猪的表型分析

3.1 材料与方法

3.1.1 试验动物

3.1.2 仪器与试剂

3.1.3 胴体性状检测及组织样品采集

3.1.4 RT-PCR及荧光定量PCR

3.1.5 Western Blot检测

3.1.6 ELISA检测

3.1.7 血液生理生化指标检测

3.1.8 组织学检测分析

3.1.9 肌纤维数目与横街面积的分析

3.1.10 肌肉肉质的检测

3.1.11 数据分析

3.2 结果与分析

3.2.1 MSTN基因编辑猪靶基因mRNA及氨基酸序列变化情况

3.2.2 MSTN基因编辑猪的靶基因转录及表达情况

3.2.3 MSTN基因编辑猪的胴体性状检测结果

3.2.4 MSTN基因编辑猪的肌纤维变化情况

3.2.5 MSTN基因编辑猪脊椎组成情况

3.2.6 MSTN基因编辑猪的血液生理生化指标检测结果

3.2.7 MSTN基因编辑猪内脏组织病理学检测结果

3.2.8 MSTN基因编辑猪的肉质及营养成分检测结果

第四章讨论

4.1 针对MSTN基因编辑猪特点及安全性的讨论

4.2 针对肌纤维表型的讨论

4.3 针对胸腰椎模式变化的讨论

4.4 针对肉质性状检测结果的讨论

第五章结论

参考文献

致谢

附录

作者简历

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