水稻耐盐相关基因RST1的图位克隆及功能分析

发布时间：2018-04-16 06:49

本文选题：水稻 + 耐盐性　；参考：《南京农业大学》2016年博士论文

【摘要】：土壤盐渍化是世界范围内严重影响作物生产的重要因素。水稻是盐敏感作物,尽管如此,它仍然是沿海地区广泛种植的最为重要的农作物之一。通过遗传改良来提高水稻耐盐能力,是进一步增加沿海受土壤盐渍化影响地区水稻种植面积和提高水稻产量的有效手段。长期以来,大量的研究采用传统的育种方法改良水稻的耐盐性,但仍然难度较大,进展缓慢,究其主要原因,一方面由于具有较强耐盐性的水稻遗传资源十分有限;另一方面,耐盐性是数量性状,遗传基础较为复杂,人们对其了解尚少。因此,鉴定优异的水稻耐盐遗传种质资源、克隆耐盐关键基因、解析水稻耐盐机制,对于水稻耐盐遗传育种尤为重要。生长素毫无疑问是植物中最为重要的信号分子,它在植物从胚胎形成到衰老的整个生命进程中对于调控植物的生长和发育起着关键作用。ARF是生长素信号中一类重要的转录调控因子,它能与下游生长素调控基因启动子上的生长素响应元件(AuxRE)结合,激活或抑制下游调控基因的表达。过去的研究中以ARF转录激活因子为多,ARF转录抑制因子的功能仍然不是很清楚。最近,研究者发现拟南芥转录抑制因子ARF2和ARF10/16分别参与植物响应干旱和A1胁迫的转录调控过程,暗示ARF介导了非生物胁迫信号和植物内源生长发育信号相互作用,但ARF转录因子如何参与非生物胁迫响应及其转录调控机理至今还不是很清楚。本研究从水稻耐盐相关突变体资源筛选入手,在实验室已有的日本晴EMS突变体库中鉴定分离到4个纯合盐敏感突变体rss4(ricesaltsensitive 4)、rss5、rss6、rss7和1个纯合耐盐突变体rst1(rice salt tolerant 1)。这些突变体耐盐性的变化很可能是由于在盐胁迫下地上部限制Na+积累的能力不同所导致。与野生型相比,盐胁迫下rss4、rs5、rss6、rss7地上部均积累更多的Na+,而rst1地上部积累的Na+更少。本研究针对耐盐突变体rst1做更进一步的图位克隆工作以及耐盐功能初步解析。遗传分析表明rst1突变体耐盐性的变化受单隐性核基因控制。通过分子标记连锁图谱构建和初定位群体地上部Na+含量检测,在全基因组范围扫描到2个控制地上部Na+含量的QTL位点(qSNC-4和qSNC-6)。qSNC-4和qSNC-6位点处降低地上部Na+含量的等位基因分别来源于PA64和rst1,初步确定qSNC-6是所要寻找的目标QTL。扩大定位群体,利用极端耐盐单株对qSNC-6进行精细定位,将目标区域缩小至标记IM29432和IM29477之间物理距离约为45kb的染色体区段内,该区段内包含5个基因。DNA测序和比对发现,rst1突变体在该区间仅存在一个突变位点,即ORF5基因起始密码子后第990个碱基(位于第一个外显子上),由G变为A,对应的氨基酸由Trp变为终止密码子,导致提前终止。ORF5基因编码ARF(Auxin response factor)蛋白家族中的成员之一,本文中用OsARFx表示。转基因回补材料和T-DNA插入突变体耐盐表型鉴定均确认了OsARFx是RST1的候选基因。qRT-PCR和GUS组织染色显示RST1在大多数组织器官中均有不同程度表达,叶片中叶肉细胞表达较强,花器官中仅在雄蕊表达,根部外皮层、皮层厚壁细胞、中柱表达较强。RST1的表达能被盐处理和干旱处理诱导。亚细胞定位分析发现RST1主要定位在细胞核。RST1是一个转录因子,转录活性实验表明RST1具有转录抑制活性。RNA-seq、qRT-PCR、EMSA体外结合实验表明RST1可能抑制氮吸收和代谢相关基因的表达。此外,RST1还能与OsARF8、OsARF11、OsARF22相互作用形成复合体。这与前人已有的研究相似,不同之处在于,RST1通过N端与OsARF8、OsARF11、OsARF22,而其它研究结果中ARF之间多通过C端相互作用形成二聚体。通过生物信息学分析发现,RST1在进化中特别保守,与常见单子叶作物和杂草亲缘关系最近,氨基酸相似度最高;单倍型分析RST1基因在水稻自然变异中多态性很低,无实质的功能缺失变异。综上所述,本文通过耐盐性筛选找到一个耐盐突变体rst1。经过图位克隆发现rst1耐盐性的提高是由于编码OsARFx的基因突变导致。功能分析表明RST1在盐胁迫下被诱导,可能通过抑制氮吸收和代谢相关基因的表达负调控水稻耐盐性。RST1在水稻中自然变异程度低,在其它常见单子叶作物和杂草中保守,本研究为水稻和其它作物耐盐遗传育种提供了理论指导。
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【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S511

【参考文献】