猪PML的抗病毒作用及伪狂犬病毒对其产生的拮抗机制研究

发布时间：2016-12-02 19:41

本文关键词：猪PML的抗病毒作用及伪狂犬病毒对其产生的拮抗机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

《中国农业大学》 2015年

猪PML的抗病毒作用及伪狂犬病毒对其产生的拮抗机制研究

许傲天

【摘要】：PML核体(PML-NBs)是哺乳动物细胞中普遍存在一种动态的亚细胞核结构。PML是PML核体的主要组织者,参与多种生物学过程。PML核体具有天然的抗病毒作用,与病毒感染和致病性有着密切的关系。目前PML抗病毒的机制还不十分清楚,对PML生物学功能的研究也主要集中在人和小鼠,对其他动物PML功能研究很少,开展猪PML抗病毒作用的研究有助于深入理解PML抗病毒的机制。为开展猪PML抗病毒作用研究,对猪PML基因进行了克隆和特异性抗体制备；对猪PML核体的亚细胞定位、形态结构及生物学功能进行分析；并以猪伪狂犬病毒(PRV)感染为模型,探讨了猪PML核体和病毒之间的相互作朋。 PRV感染可以干扰猪PML-NBs的形成,为了进一步研究病毒哪些基因参与到这一过程,建立了一种基于CRISPR/Cas9系统构建基因缺失PRV的方法,将PRV基因组和CRISPR/Cas9系统共转染PK15细胞,拯救出来的病毒几乎100%是被CRISPR/Cas9编辑过的基因缺失病毒；还建立了一种不依赖同源重组机制向PRV基因组插入外源基因的方法,该方法仅需要构建一个包含打靶序列和外源基因表达盒的供体质粒,将供体质粒、病毒基因组和CRISPR/Cas9系统共转PK15细胞,拯救出来外源基因插入的重组病毒效率高达50%。稳定表达猪PMLⅡ可以抑制野生型PRV增殖,而且对EP0缺失毒株的抑制能力更强,显示猪PML具有抗病毒作用。利用TALEN技术构建猪PML敲除的PK15细胞系(SPML-/-PK15),在SPML+/+PK15细胞系上,猪IFNa对野生型及EP0缺失病毒均有较强抑制作用,且对EP0缺失病毒抑制作用强于野生型病毒;但在SPML-/-PK15细胞系上,猪IFNa对野生型及EP0缺失PRV抑制作用减弱,同时猪IFNa对两种病毒抑制能力的差异减小,说明猪内源性PML对猪IFNa介导抗病毒作用至关重要,提示猪PML参与到猪IFNα诱导的固有免疫中。在PRV感染早期,猪PML-NBs的形态结构就遭到破坏,病毒早期蛋白EP0可以干扰猪内源性和稳定表达猪PMLⅡ形成的PML-NBs,而EP0缺失毒株干扰猪PML-NBs的能力显著下降。野生型PRV感染引起稳定表达的猪PMLⅡ降解,降解过程依赖蛋白酶体途径,EP0缺失病毒对猪PML降解能力显著降低,表明在感染早期对猪PML-NBs的破坏主要是由EP0介导的。综上所述,本文克隆、鉴定猪PML;证明了猪PML本身具有抗病毒作用以及参与IFNa介导的抗病毒防御；并初步探讨PRV干扰猪PML-NBs形成及逃逸猪PML抗病毒的机制；建立了一种基于CRISPR/Cas9系统构建基因缺失PRV的方法,为深入了解猪PML抗病毒及PRV逃逸宿主防御的机制奠定了基础。

【关键词】：
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S858.28
【目录】：

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