四种水生蔬菜的转录组学研究及EST-SSR标记的开发

发布时间：2017-03-23 01:09

  本文关键词：四种水生蔬菜的转录组学研究及EST-SSR标记的开发，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：水生蔬菜的很多种类原产于我国,栽培历史悠久,因其富含丰富的营养、独特的口感和良好的保健功能,深受菜农和大众的喜爱。但是目前针对水生蔬菜的遗传学研究和基因组信息还比较缺乏。鉴于此,针对四种常见的水生蔬菜(莲(Nelumbo nucifera)、芋(Colocasia esculenta (L.) Schoot)、慈姑(Sagittaria Trifolia L. var. sinensis (Sims) Makino)和荸荠(Eleocharis dulcis)),本文开展了转录组学研究,EST-SSR标记的开发,品种间亲缘关系鉴定,指纹图谱构建以及品种纯度鉴定等研究工作。主要研究结果如下：1.莲的转录组学研究,EST-SSR标记的开发及栽培品种间亲缘关系的鉴定。本研究应用Illumina HiSeqTM2000平台对野生花莲和栽培藕莲的顶芽进行转录组深度测序并进行生物信息学分析,分别获得10.1Gbp和9.9Gbp的短序列,通过Trinity软件进行从头组装,分别得到111,925和100,016个叠连群,其序列长度超过200bp,经过进一步地拼装,获得105,834个共有叠连群,平均长度为722bp。利用MISA软件检测到11,178个SSR位点,再通过Primer3.0软件设计了6,568对引物。我们利用Perl脚本根据电子多态性预测合成了38对引物；又随机合成了72对引物,用51份莲样品验证它们的扩增效果和多态性,其中91(82.7%)对引物扩增成功,其中80对引物具有多态性。每个位点的等位基因数量为2到17个,多态性信息含量(PIC)值为0.19-0.87。基于Jaccard相似系数的UPGMA树系图表明莲亲缘关系与地理分布的相关性较低,而与表型性状有一定的相关性。2.芋的转录组学研究,EST-SSR标记的开发及栽培品种间亲缘关系的鉴定。本研究应用Illumina TruSeqTM平台对芋的营养生长期叶片进行转录组深度测序并进行生物信息学分析。我们共获得4.5Gbp的短序列,平均长度为100bp,通过Trinity软件进行从头组装,得到52,935个叠连群,平均长度为588.5bp。对转录本数据进行了NR, GO和KOG注释分类和KEGG代谢通路分析。利用MISA软件检测到5,278个SSR位点,再通过Primer3.0软件设计了2,858对引物。我们随机合成了其中的100对引物,并用69份样品(其中68份芋和1份海芋(Alocasia macrorrhiza))验证它们的扩增效果和多态性,其中72(72.0%)对引物扩增成功,62对引物具有多态性。每个位点的等位基因数量为2到14个,多态性信息含量(PIC)值为0.01-0.82。从芋中开发的SSR标记在海芋中的转移率为36.11%(26/72)。基于Jaccard相似系数的UPGMA树系图表明芋的亲缘关系与形态特征或地理分布没有明显的相关性。3.慈姑的转录组学研究,EST-SSR标记的开发及品种间亲缘关系的鉴定。本研究应用Illumina TruSeqTM平台对慈姑的营养生长期叶片进行转录组深度测序并进行生物信息学分析。我们共获得4.7Gbp的短序列,平均长度为100bp,通过Trinity软件进行从头组装,得到51,836个叠连群,平均长度为680bp。对转录本数据进行了NR,GO和KOG注释分类和KEGG代谢通路分析。利用MISA软件检测到3,861个SSR位点,再通过Primer3.0软件设计了2,476对引物。我们随机合成了其中的100对引物,并用81份样品(其中79份慈姑和2份矮慈姑(Sagittaria pygmaea))验证它们的扩增效果和多态性,其中79(79.0%)对引物扩增成功,其中68对引物具有多态性。每个位点的等位基因数量为2到11个,多态性信息含量(PIC)值为0.01-0.84。从慈姑中开发的SSR标记在矮慈姑中的转移率为91.14%(72/79)。基于Jaccard相似系数的UPGMA树系图表明慈姑的亲缘关系与地理分布有一定的相关性。4.荸荠的转录组学研究,EST-SSR标记的开发。本研究应用Illumina TruSeqTM平台对慈姑的营养生长期叶片进行转录组深度测序并进行生物信息学分析。我们共获得4.7Gbp的短序列,平均长度为100bp,通过Trinity软件进行从头组装,得到40,796个叠连群,平均长度为616.6bp。对转录本数据进行了NR,GO和KOG注释分类和KEGG代谢通路分析。利用MISA软件检测到2,570个SSR位点,再通过Primer3.0软件设计了1,606对引物。我们随机合成了其中的100对引物,验证它们的扩增效果,其中77(77.0%)对引物扩增成功。5.三种水生蔬菜的SSR指纹图谱的构建及品种纯度鉴定。以22份中国莲栽培品种为材料,结合本研究开发的SSR引物,构建其SSR指纹图谱,并从中筛选出6对高多态性并能区分所有材料的引物作为核心引物,再选出3对多态性信息含量(PIC)值较高的引物作为候选引物,利用这些引物对90份太空莲36号材料进行纯度鉴定,结果表明其纯度为93.3%(84/90)。以46份芋栽培品种为材料,结合本研究开发的SSR引物,构建其SSR指纹图谱,并从中筛选出20对高多态性并能区分所有材料的引物作为核心引物。利用前12对核心引物对90份山东8502芋材料进行纯度鉴定,结果表明其纯度为98.9%(89/90)。以10份慈姑栽培品种为材料,结合本研究开发的SSR引物,构建其SSR指纹图谱,并从中筛选出3对高多态性并能区分所有材料的引物作为核心引物,再选出9对多态性信息含量(PIC)值较高的引物作为候选引物。利用这些引物对90份武汉慈姑进行纯度鉴定,得到武汉慈姑的纯度为100.0%(90/90)。本研究首次对四种水生蔬菜进行转录组学研究,利用深度测序技术获得了大量的转录组序列及EST-SSR标记,对进一步开展功能基因克隆,遗传多样性分析,种质资源鉴定以及标记辅助育种均有重要的意义。
【关键词】：水生蔬菜 莲 芋 慈姑 荸荠 转录组 EST-SSR 遗传多样性 品种纯度鉴定
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S645
【目录】：

• 论文创新点6-11
• 摘要11-14
• ABSTRACT14-17
• 第一章 概述17-40
• 1.1 水生蔬菜概述17-22
• 1.1.1 本研究涉及的四种水生蔬菜17-21
• 1.1.2 水生蔬菜的应用价值及面临的问题21-22
• 1.2 新一代测序技术及其应用22-28
• 1.2.1 新一代测序技术在作物遗传和育种上的应用23-27
• 1.2.2 作物改良的前景27-28
• 1.3 遗传标记28-37
• 1.3.1 形态学标记28-29
• 1.3.2 细胞学标记29-30
• 1.3.3 生物化学标记30
• 1.3.4 免疫学标记30-31
• 1.3.5 分子标记31-37
• 1.4 分子标记的应用37-38
• 1.4.1 遗传图谱的构建37
• 1.4.2 品种指纹图谱的构建37-38
• 1.4.3 分子标记辅助选择育种38
• 1.5 本研究的目的及意义38-40
• 第二章 莲的转录组学研究和EST-SSR的开发40-59
• 2.1 前言40-41
• 2.2 材料和方法41-49
• 2.2.1 实验材料41-43
• 2.2.2 试剂及仪器43-44
• 2.2.3 莲cDNA文库的构建及测序44-45
• 2.2.4 EST-SSR标记开发45
• 2.2.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳45-47
• 2.2.6 花莲和藕莲EST-SSR位点多态性的预测分析47-49
• 2.2.7 数据分析49
• 2.3 结果与分析49-56
• 2.3.1 莲转录组通过Illumina测序的原始数据的组装49-50
• 2.3.2 不同类型的EST-SSR位点的识别、频率和分布50-52
• 2.3.3 EST-SSR标记的开发和验证52-53
• 2.3.4 花莲和藕莲EST-SSR位点多态性的预测分析53-56
• 2.3.5 莲的栽培品种和野生型的遗传多样性分析56
• 2.4 讨论56-59
• 第三章 芋的转录组学研究和EST-SSR的开发59-81
• 3.1 前言59-60
• 3.2 材料与方法60-64
• 3.2.1 实验材料60-62
• 3.2.2 试剂及仪器62
• 3.2.3 芋cDNA文库的构建和测序62-63
• 3.2.4 基因预测及注释、功能基因分类和代谢途径的构建63
• 3.2.5 EST-SSR标记开发63
• 3.2.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳63
• 3.2.7 数据分析63-64
• 3.3 结果与分析64-76
• 3.3.1 芋转录组通过Illumina测序的原始数据的组装64-65
• 3.3.2 基因预测及注释、功能基因分类和代谢途径的构建65-68
• 3.3.3 不同类型的EST-SSR位点的识别、频率和分布68-71
• 3.3.4 EST-SSR标记的开发、验证及其转移率71-75
• 3.3.5 芋的遗传多样性分析75-76
• 3.4 讨论76-81
• 第四章 慈姑的转录组学研究和EST-SSR的开发81-100
• 4.1 前言81-82
• 4.2 材料与方法82-86
• 4.2.1 实验材料82-85
• 4.2.2 试剂及仪器85
• 4.2.3 慈姑cDNA文库的构建和测序85
• 4.2.4 基因预测及注释、功能基因分类和代谢途径的构建85
• 4.2.5 EST-SSR标记开发85
• 4.2.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳85
• 4.2.7 数据分析85-86
• 4.3 结果与分析86-97
• 4.3.1 慈姑转录组通过Illumina测序的原始数据的组装86-87
• 4.3.2 基因预测及注释、功能基因分类和代谢途径的构建87-91
• 4.3.3 不同类型的EST-SSR位点的识别、频率和分布91-94
• 4.3.4 EST-SSR标记的开发、验证及其转移率94-96
• 4.3.5 慈姑的遗传多样性分析96-97
• 4.4 讨论97-100
• 第五章 荸荠的转录组学研究和EST-SSR的开发100-111
• 5.1 前言100
• 5.2 材料和方法100-102
• 5.2.1 实验材料100-101
• 5.2.2 试剂及仪器101
• 5.2.3 荸荠cDNA文库的构建和测序101
• 5.2.4 基因预测及注释、功能基因分类和代谢途径的构建101
• 5.2.5 EST-SSR标记开发101
• 5.2.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳101
• 5.2.7 数据分析101-102
• 5.3 结果与分析102-109
• 5.3.1 荸荠转录组通过Illumina测序的原始数据的组装102-103
• 5.3.2 基因预测及注释、功能基因分类和代谢途径的构建103-106
• 5.3.3 不同类型的EST-SSR位点的识别、频率和分布106-109
• 5.3.4 EST-SSR标记的开发和验证109
• 5.4 讨论109-111
• 第六章 三种水生蔬菜的SSR指纹图谱的构建及品种纯度鉴定111-127
• 6.1 前言111-112
• 6.2 材料和方法112-117
• 6.2.1 实验材料112-116
• 6.2.2 试剂及仪器116
• 6.2.3 PCR扩增116
• 6.2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳116
• 6.2.5 数据分析116-117
• 6.3 结果与分析117-125
• 6.3.1 三种水生蔬菜的SSR核心及候选引物117-119
• 6.3.2 三种水生蔬菜的二进制分子身份证119-124
• 6.3.3 三种水生蔬菜的品种纯度鉴定124-125
• 6.4 讨论125-127
• 结束语127-128
• 参考文献128-143
• 攻博期间发表的科研成果目录143-145
• 致谢145-146

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  本文关键词：四种水生蔬菜的转录组学研究及EST-SSR标记的开发，，由笔耕文化传播整理发布。

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