内蒙古绒山羊胎儿期毛囊发生发育相关基因的筛选与鉴定
发布时间：2020-07-24 19:58
【摘要】：绒山羊的绒毛具有较高的经济价值,毛囊性状对绒毛产量和品质有十分重要的影响。近年来,有关绒山羊毛囊周期性生长的分子调控机理取得较大的研究进展,但毛囊在胚胎期启动、生长发育过程的分子调控机理相关研究还相对匮乏。目前,生命科学研究进入了后基因组时代,转录组学和蛋白质组学是功能基因组学研究的重要内容,同时也为研究毛囊生长发育分子作用机制提供了很好的途径。本研究采集了绒山羊10个不同时期的胎儿皮肤,根据前期研究结果对45天(d)、55天(d)和65天(d)的绒山羊胎儿(E45,E55和E65)体侧皮肤(相同时期的3个样本作为生物学重复)进行了转录组和蛋白组测序,分别采用荧光定量PCR(qPCR)和蛋白免疫印迹(Western blot, WB)对测序结果进行了验证,并对两组学数据联合分析发掘与绒山羊胚胎期毛囊启动、生长发育相关的基因、蛋白,为研究绒山羊胎儿期毛囊发生、发育分子调控机理提供研究基础。主要研究结果如下：1.通过转录组测序共测得平均每个样品11G的转录组数据量,差异表达分析发现3个时期差异表达基因4581个,其中E55 vs.E45有1590个差异表达基因,E65 vs.E55有2442个差异表达基因,E65 vs.E45有3844个差异表达基因(P≤0.05)。qPCR随机检测了10个差异基因在E45,E55和E65的表达量,发现其中8个基因的表达结果和RNA-seq一致。2.通过K-means方法分析基因表达模式,发现3个时期的4581个差异基因可以分为10类,每一类基因在毛囊的发生发育过程中可能发挥相近的功能；基因表达谱聚类(Hierarchical clustering)分析,发现E55和E45表达谱相近。GO功能分析发现差异基因显著富集在细胞成分,分子功能和生物过程等方面(P0.05)。KEGG通路分析发现部分差异基因注释在WNT、TGFβ和ECM受体相互作用等通路中,存在于这些通路的重要差异基因可作为绒山羊毛囊发生、发育关键候选基因。通过高通量测序分析了3个时期9个样品的可变剪接类型,包括A5SS, A3SS, ES和IR,其中最普遍的剪切事件为IR。3.检测毛囊生长发育的关键候选基因SFRP4, WNT3, WNT10a和APC2在胎儿期10个不同阶段的表达模式,发现这4个基因在E45,E55和E65的表达与RNA-seq一致,进一步验证了RNA-seq结果准确性的同时,初步探讨了Wnt转导通路差异基因在绒山羊毛囊在胚胎期启动、生长发育过程可能发挥的作用。4.通过ITRAQ鉴定到E45,E55和E653个时期胎儿皮肤共有蛋白质1172个,差异蛋白质378个,其中E55 vs.E45有143个差异蛋白质,E65 vs. E55有176个差异蛋白,E65 vs.E45有201个差异蛋白(P0.05)。利用WB技术检测Decorin蛋白在E45,E55和E65的表达,结果与ITRAQ一致。5.GO富集分析发现,差异蛋白在属于细胞过程、代谢过程和生物学调节等的生物学过程中富集；分子功能属性上,在结合和催化活性等过程富集;细胞组分属性上,在细胞和细胞器富集较多差异蛋白质。KEGG分析发现部分差异蛋白质注释到ECMR interaction, Focal adhesion, PI3K-Akt, MAPK, TGF-beta, VEGF、WNT和p53等信号通路中。用Cluser 3.0对随着胎儿发育表达量显著差异质的188个蛋白进行聚类分析(P0.05),发现其中159个差异蛋白质表现出3种明显的变化趋势,其中63个蛋白质在整个检测时期持续上升,45个蛋白质持续下降及50个蛋白质呈先上升后下降趋势。6.转录组和蛋白组数据联合分析发现后两个时期共同差异上调基因238个,下调表达基因920个,胎儿55～65天发育阶段比胎儿45～55天发育阶段差异上调表达585个基因,下调表达1348个差异基因。发现后两个时期共同差异上调蛋白31个,下调表达蛋白28个,胎儿55～65天发育阶段比胎儿45～55天发育阶段差异上调表达69个蛋白,下调表达96个差异蛋白。其中,部分基因如DCN,KRT7, OXCT1, MYH10和ANPEP等的RNA-seq和ITRAQ测序数据在3个胎儿时期中的变化趋势一致。7.对Decorin(DCN)在绒山羊胎儿皮肤10个时期的mRNA和蛋白的表达谱进行研究。发现Decorin(DCN)在mRNA和蛋白水平上都是45天,55天和65天时表现持续上调趋势,75天,95天和105天皮肤中表达量相对其他胎儿时期较高,115天,125天和135天的表达量出现下降趋势。8.为后期从细胞水平研究DCN基因的作用机制,构建过表达载体pEGFP-CI/DCN。
【学位授予单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S827
【图文】：
图１可Y 剪接的剪接方式逡逑Ｆｉｇ．ｌ邋Ｔｙｐｅｓ邋ｏｆ邋ａｈｅｍａｔｉｖｅ邋ｓｐｌｉｃｉｎｇ逡逑．５．２转录组测序技术（ＲＮＡ－ｓｅｑ）逡逑近年来，随着下一代高通量测序技术在转录组学研巧的大量运用，转录组测逡逑技术（ＲＮＡ－ｓｅｑ）己能够全面、高效的检测某一物种，某一特定组织、某一特定生逡逑状态下的所有转录本的序列信息。对于有参考基因组序列的物种的转录组测序逡逑程如图２。转录组测序技术（ＲＮＡ－ｓｅｑ）作为一种有效检测转录本信息的技术，逡逑点有Ｗ下几个方面：（１）该技术不需要引入特异性探针，不需要基因组信息，逡逑没有基因组注释的物种也能进行分析，因此可对任意物种进行全面的转录组分逡逑：（２）数字化信号，能检测几乎所有转录本信息，高覆盖度；（３）检测阔值跨逡逑宽，高达６个数量级：（４）可对检测单碱基的差异，高分辨率；（５）检测范围逡逑，稀有的转录本也可进行检测，因此。ＲＮＡ－ｓｅｑ在检测可变剪接（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ逡逑ｐｌｉｃｉｎｇ）邋１６３４＂、挖掘单核昔酸多态性（ＳＮＰ）邋Ｕ３’邋６Ｗ９Ｉ和简单重复序列（ＳＳＲ）邋等方逡逑
内蒙古农业大学巧±学位论文样本的同一蛋白质在一级质谱（ＭＳ＇）中，有相同的质荷联质谱中，由于报告基团、质量平衡基团和多r婪从帕科胶饣哦В芗觳獾奖徊煌凰乇昙堑耐坏鞍祝保保矗保保担保保逗停保保罚模岬谋ǜ胬胱樱ǜ胬胱拥那慷燃创分型桓龌蔚姆岫龋ǎ幔猓酰睿洌幔睿悖澹ü治稣庑┍扑愕鞍字试诓煌芳涞谋泶锪勘戎担簦椋住＃桑裕遥粒鸭际跸啾龋渥畲蟮挠攀剖峭扛撸峁煽浚芡狈治觯玻冈吹牡鞍字恃罚ㄏ赴⒆橹⑻逡旱龋┒寄懿捎酶梅椒槊舳戎势滓瞧鳎ㄈ纾粒拢桑担叮埃埃诲澹裕瑁澹颍恚铮疲椋螅瑁澹颍眩牛┑闹始ㄊ亢投烤范取＃桑裕遥粒鸭际醯娜钡闶且远啻砗褪约练延枚冀细摺ｅ义
本文编号：2769319
【学位授予单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S827
【图文】：
图１可Y 剪接的剪接方式逡逑Ｆｉｇ．ｌ邋Ｔｙｐｅｓ邋ｏｆ邋ａｈｅｍａｔｉｖｅ邋ｓｐｌｉｃｉｎｇ逡逑．５．２转录组测序技术（ＲＮＡ－ｓｅｑ）逡逑近年来，随着下一代高通量测序技术在转录组学研巧的大量运用，转录组测逡逑技术（ＲＮＡ－ｓｅｑ）己能够全面、高效的检测某一物种，某一特定组织、某一特定生逡逑状态下的所有转录本的序列信息。对于有参考基因组序列的物种的转录组测序逡逑程如图２。转录组测序技术（ＲＮＡ－ｓｅｑ）作为一种有效检测转录本信息的技术，逡逑点有Ｗ下几个方面：（１）该技术不需要引入特异性探针，不需要基因组信息，逡逑没有基因组注释的物种也能进行分析，因此可对任意物种进行全面的转录组分逡逑：（２）数字化信号，能检测几乎所有转录本信息，高覆盖度；（３）检测阔值跨逡逑宽，高达６个数量级：（４）可对检测单碱基的差异，高分辨率；（５）检测范围逡逑，稀有的转录本也可进行检测，因此。ＲＮＡ－ｓｅｑ在检测可变剪接（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ逡逑ｐｌｉｃｉｎｇ）邋１６３４＂、挖掘单核昔酸多态性（ＳＮＰ）邋Ｕ３’邋６Ｗ９Ｉ和简单重复序列（ＳＳＲ）邋等方逡逑
内蒙古农业大学巧±学位论文样本的同一蛋白质在一级质谱（ＭＳ＇）中，有相同的质荷联质谱中，由于报告基团、质量平衡基团和多r婪从帕科胶饣哦В芗觳獾奖徊煌凰乇昙堑耐坏鞍祝保保矗保保担保保逗停保保罚模岬谋ǜ胬胱樱ǜ胬胱拥那慷燃创分型桓龌蔚姆岫龋ǎ幔猓酰睿洌幔睿悖澹ü治稣庑┍扑愕鞍字试诓煌芳涞谋泶锪勘戎担簦椋住＃桑裕遥粒鸭际跸啾龋渥畲蟮挠攀剖峭扛撸峁煽浚芡狈治觯玻冈吹牡鞍字恃罚ㄏ赴⒆橹⑻逡旱龋┒寄懿捎酶梅椒槊舳戎势滓瞧鳎ㄈ纾粒拢桑担叮埃埃诲澹裕瑁澹颍恚铮疲椋螅瑁澹颍眩牛┑闹始ㄊ亢投烤范取＃桑裕遥粒鸭际醯娜钡闶且远啻砗褪约练延枚冀细摺ｅ义
本文编号：2769319
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