H9N2禽流感病毒感染血管内皮细胞的基因表达谱研究

发布时间：2017-04-02 10:12

  本文关键词：H9N2禽流感病毒感染血管内皮细胞的基因表达谱研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：H9N2亚型禽流感病毒在禽类中长期存在,偶而通过密切接触感染人类。血管内皮细胞被认为在病毒感染时在固有免疫细胞的募集,早期细胞因子和趋化因子的产生中发挥重要作用。但目前关于机体对H9N2禽流感病毒感染血管内皮细胞的相关研究还很少。 本实验,我们研究内皮细胞是否支持H9N2禽流感病毒的增殖并分析病毒接种内皮细胞后细胞的基因表达谱。在第一部分实验,我们用H9N2禽流感病毒(A/Chicken/Hebei/4/2008)接种人脐静脉内皮细胞,并用空斑形成试验检测释放到细胞培养液中的病毒滴度。我们发现病毒接种血管内皮细胞后,随着初始病毒接种量的增加,细胞培养液中细胞释放的病毒量相应的增加,提示H9N2禽流感病毒可在人脐静脉内皮细胞上增殖。 在第二部分实验,我们分别用感染复数为5的活病毒和p-丙内酯灭活的病毒接种血管内皮细胞,并在接种细胞24小时后用基因芯片检测细胞的基因表达谱。基因芯片结果显示H9N2禽流感病毒接种血管内皮细胞后诱导细胞出现大量基因的差异表达(其中2091个基因表达上调,4209个基因表达下调),呈现出病毒感染的转录特征。灭活病毒接种细胞后只诱导细胞出现少量基因的差异表达(总计263个差异表达基因,其中177个基因上调,86个基因下调)。这之后,我们主要关注三方面细胞转录水平变化的基因。首先,我们分析了与血管内皮细胞自身结构和功能相关的基因。这些基因包括凋亡相关基因,粘附分子基因和紧密连接蛋白基因。通过基因生物学过程富集分析,我们发现H9N2禽流感病毒感染细胞后诱导317个与细胞凋亡相关的差异表达基因,提示H9N2禽流感病毒感染对细胞产生了深远的影响。激活的血管内皮细胞表达的粘附分子介导白细胞的粘附和跨内皮迁移。我们发现H9N2禽流感病毒感染细胞后诱导粘附分子基因差异表达(ICAM1基因显著下调,ICAM4和SELE基因显著上调)。紧密连接蛋白的变化可能会导致内皮渗漏。我们发现H9N2禽流感病毒感染细胞后显著下调紧密连接蛋白基因(OCLN, CLDN1、 CLDN11和CLDN23)。其次,我们分析了促炎性细胞因子基因和趋化因子基因的差异表达情况。流感病毒感染的特征是在肺部募集大量固有免疫细胞并伴有大量促炎性细胞因子和趋化因子的释放。我们并没有发现促炎性细胞因子基因发生差异表达(包括TNF、ILIA、IL1B、IL6和IL10)。但是我们在H9N2禽流感病毒和灭活病毒接种的细胞中检测到高表达的趋化因子基因(包括CCL5、CXCL10和CXCL11)。最后我们分析了干扰素基因和干扰素诱导基因(interferon-stimulated genes, ISGs)的差异表达情况。Ⅰ型干扰素被认为在病毒感染时诱导干扰素诱导蛋白的表达,这其中的一些蛋白具有直接的抗病毒作用。尽管干扰素基因和干扰素蛋白未发生显著改变,但基因芯片数据显示H9N2禽流感病毒和灭活病毒接种血管内皮细胞后,上调幅度最高的基因是干扰素诱导基因。这些高表达的干扰素诱导基因可以编码干扰素诱导蛋白(包括IFIT1、IFIT2、IFIT3和IFIT5),干扰素诱导跨膜蛋白(IFITM1和IFITM2),2’,5’-寡腺苷酸合成酶(OAS1和OAS2)。另外,值得注意的是灭活H9N2禽流感病毒诱导的干扰素诱导基因上调幅度比H9N2禽流感病毒诱导的幅度高。这些结果提示血管内皮细胞主要通过H9N2禽流感病毒颗粒与细胞相互作用而较少依赖病毒的复制过程诱导细胞表达干扰素诱导基因。我们推测血管内皮细胞内有一套不依赖干扰素的抗病毒机制。 在最后一项实验中,我们发现在H9N2禽流感病毒感染的血管内皮细胞培养基中加入一定剂量的黄芩苷对病毒的增殖有一定的影响。我们通过基因芯片分析还发现黄芩苷处理病毒感染的血管内皮细胞时,诱导一些与细胞自身生物学过程相关的基因差异表达及病毒复制相关基因差异表达,而抗病毒相关基因未发生差异表达。 综上所述,我们的结果显示人脐静脉内皮细胞支持H9N2禽流感病毒的增殖,H9N2禽流感病毒和灭活H9N2禽流感病毒作用于人脐静脉内皮细胞都可以诱导细胞显著上调干扰素诱导基因和趋化因子基因。另外,我们发现H9N2禽流感病毒感染血管内皮细胞后诱导细胞凋亡相关基因表达并显著下调紧密连接蛋白基因。这些数据为进一步深入研究H9N2禽流感病毒与血管内皮细胞相互作用提供了参考资料。
【关键词】：H9N2亚型禽流感病毒 人脐静脉内皮细胞 基因芯片 基因表达谱 黄芩苷
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 目录9-13
• 插图清单13-14
• 插表清单14-15
• 中英文对照缩略词表15-16
• 第一章 文献综述及试验设计16-32
• 1.1 A型流感病毒综述16-20
• 1.1.1 流感病毒的分类与命名16
• 1.1.2 A型流感病毒粒子的结构16-17
• 1.1.3 A型流感病毒基因组及其编码的蛋白质17-19
• 1.1.4 A型流感病毒的复制周期19-20
• 1.2 H9N2亚型禽流感病毒的研究进展20-23
• 1.2.1 H9N2亚型禽流感病毒的流行情况21
• 1.2.2 H9N2亚型禽流感病毒与其它亚型流感病毒之间的关系21-22
• 1.2.3 H9N2亚型禽流感病毒感染哺乳动物及人类的研究进展22-23
• 1.3 流感病毒感染血管内皮细胞的研究进展23-26
• 1.3.1 血管内皮细胞的结构与功能23-25
• 1.3.2 病毒感染血管内皮细胞研究进展25-26
• 1.3.3 流感病毒感染血管内皮细胞研究进展26
• 1.4 黄芩苷作用及机制研究进展26-27
• 1.4.1 黄芩苷的药理作用26-27
• 1.4.2 黄芩苷的抗流感病毒的作用27
• 1.5 基因芯片研究进展27-29
• 1.5.1 基因芯片介绍27
• 1.5.2 基因芯片原理27-28
• 1.5.3 基因芯片的分类28
• 1.5.4 基因芯片的应用28
• 1.5.5 基因芯片用于流感病毒感染实验的研究28-29
• 1.6 本课题的提出及意义29-30
• 1.7 试验设计30-32
• 第二章 H9N2禽流感病毒感染血管内皮细胞的研究32-48
• 2.1 引言32
• 2.2 技术路线32-33
• 2.3 主要实验材料33-36
• 2.3.1 主要实验仪器与试剂33-34
• 2.3.2 主要试剂配制34-35
• 2.3.3 病毒株和细胞35-36
• 2.4 实验方法36-39
• 2.4.1 细胞培养36-37
• 2.4.2 病毒制备37
• 2.4.3 流感病毒滴度的测定37-38
• 2.4.4 H9N2 AIV在HUVECs上的复制动力学检测38
• 2.4.5 黄芩苷对H9N2 AIV在HUVECs上的复制动力学影响38
• 2.4.6 HUVECs活性的测定38
• 2.4.7 统计学方法38-39
• 2.5 实验结果39-45
• 2.5.1 HUVECs传代培养的特征39
• 2.5.2 H9N2 AIV在HUVECs上的复制情况39-44
• 2.5.3 H9N2 AIV接种HUVECs后细胞活性44
• 2.5.4 黄芩苷对H9N2 AIV在HUVECs上复制动力学的影响44
• 2.5.5 选定基因芯片实验所需H9N2 AIV的感染复数和感染时间44-45
• 2.6 讨论45-46
• 2.6.1 H9N2 AIV在HUVECs上的增殖特性45
• 2.6.2 黄芩苷对H9N2 AIV在HUVECs上的增殖的影响45-46
• 2.7 小结46-48
• 第三章 感染H9N2禽流感病毒后血管内皮细胞的基因表达谱48-74
• 3.1 引言48
• 3.2 技术路线48-49
• 3.3 主要实验材料49-50
• 3.3.1 主要实验仪器和试剂49
• 3.3.2 基因芯片49-50
• 3.4 实验方法50-56
• 3.4.1 细胞培养及分组处理50
• 3.4.2 细胞总RNA提取、鉴定及纯化50-52
• 3.4.3 细胞总RNA反转录合成cDNA及纯化52-53
• 3.4.4 生物素标记的cRNA的合成、纯化及片段化53-54
• 3.4.5 基因芯片杂交、清洗、染色及扫描54
• 3.4.6 基因芯片数据处理54-55
• 3.4.7 差异表达基因分析55
• 3.4.8 酶联免疫吸附实验检测样品中干扰素α和干扰素β的含量55-56
• 3.4.9 统计学方法56
• 3.5 实验结果56-70
• 3.5.1 细胞总RNA提取结果56-57
• 3.5.2 基因芯片质量控制57-58
• 3.5.3 基因芯片散点图58
• 3.5.4 基因芯片数据概况58-64
• 3.5.5 选定基因表达谱分析64-68
• 3.5.6 干扰素α和干扰素β蛋白表达水平68-69
• 3.5.7 其它高表达基因列表69-70
• 3.6 讨论70-73
• 3.7 小结73-74
• 第四章 黄芩苷对H9N2禽流感病毒感染血管内皮细胞基因表达谱的影响74-80
• 4.1 引言74
• 4.2 技术路线74-75
• 4.3 主要实验材料75
• 4.3.1 主要实验仪器和试剂75
• 4.3.2 基因芯片75
• 4.4 实验方法75-76
• 4.4.1 细胞培养及分组处理75
• 4.4.2 基因芯片实验及数据处理75
• 4.4.3 统计学方法75-76
• 4.5 实验结果76-78
• 4.5.1 差异表达基因结果76-78
• 4.5.2 差异表达基因的生物学过程分析78
• 4.6 讨论78-79
• 4.7 小结79-80
• 第五章 结论与创新点80-82
• 5.1 结论80
• 5.2 创新点80-82
• 参考文献82-90
• 附录90-112
• 致谢112-114
• 作者简历114

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 刘建华;吴华;潘玉善;苑丽;苗恩果;胡功政;;黄芩苷和环丙沙星联合对鸵鸟源大肠杆菌的协同作用[J];中国畜牧兽医;2014年01期

2 高天芸;孙玉芹;周娟;洪蓓蓓;丁虹;;黄芩苷对化疗药物所致小鼠免疫低下的调节作用[J];中国生化药物杂志;2007年05期

  本文关键词：H9N2禽流感病毒感染血管内皮细胞的基因表达谱研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：282308