牛病毒性腹泻—细小病毒病二联疫苗的研制

发布时间：2017-04-07 20:11

  本文关键词：牛病毒性腹泻—细小病毒病二联疫苗的研制，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：牛病毒性腹泻(Bovine viral diarrhea,BVD)又称牛病毒性腹泻-黏膜病,通过牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)引发的牛群间的一种常发、多见的传染病。该病主要临床特征可发生牛群的持续性感染,表现为犊牛腹泻,成牛多发性黏膜病,同时产生严重的免疫抑制,母畜流产等症状。牛细小病毒病是由牛细小病毒(Bovine parvovirus,BPV)引起,可以在牛群相互接触时进行传播的一种重要的传染病。该病主要临床特征是妊娠母牛发生流产和新生犊牛发生呼吸道和消化道等病症。在美国各类兽用疫苗中排在前十位的产品中有9个产品为多价或多联疫苗,多联苗在国外牛用疫苗备受关注,同时也是发展方向。但目前国内外尚无针对牛病毒性腹泻、牛细小病毒病的二联疫苗的研制报道。本研究通过细胞培养法分离到两株牛细小病毒,建立牛细小病毒株、牛病毒性腹泻病毒株疫苗开发用毒种种子批,并且对毒种种子批是否存在内外源因子污染,两个毒株在不同细胞中的复制动力学及毒株的免疫原性进行研究。牛病毒性腹泻-细小病毒病二联疫苗工艺研究方面,通过对病毒培养过程的工艺参数、病毒收获液的灭活条件等的实验数据进行分析,确定了疫苗的制备工艺参数。最后对疫苗进行了效力和安全检查,证实通过上述工艺制备的疫苗是安全和有效。首先本研究从国内牛血清中成功分离获得两株牛细小病毒,分别命名NB0801、NB1202。这两株牛细小病毒均具有凝集豚鼠?马?人的红细胞的特性。使用Reed-Muench法进行病毒毒力测定,NB0801、NB1202两株牛细小病毒的毒力分别达到1.5×106TCID50/ml、1.2×109TCID50/ml,本实验保存的NM0901株牛病毒性腹泻病毒的毒力为1.6×107 TCID50/ml。建立了NB1202株、NM0901株疫苗开发用毒种库,对毒种库进行了内外源因子检测及毒种免疫原性方面的研究。内外源因子检测结果显示牛细小病毒NB1202株、牛病毒性腹泻病毒NM0901株无内外源因子污染。毒种免疫原性结果显示:牛细小病毒NB1202株体外抗体中和效价达到1:160,牛病毒性腹泻病毒NM0901株体外抗体中和效价达到1:40,证实两个毒株均具备较好的免疫原性。通过牛细小病毒、牛病毒性腹泻病毒在不同细胞中的复制动力学的研究。最终确定:牛陀螺状细胞(Bovine turbinate cells,BT)细胞株作为牛细小病毒疫苗生产用细胞,马-达氏牛肾细胞(Madin-Darby Bovine Kidney Cells,MDBK)作为牛病毒性腹泻病毒疫苗生产用细胞。结果显示:NB1202株、NM0901株毒种库符合牛病毒性腹泻-细小病毒病二联疫苗的研发使用。牛病毒性腹泻-细小病毒病二联疫苗工艺研究方面,对牛细小病毒NB1202株、牛病毒性腹泻病毒NM0901株在3L转瓶培养过程中,不同温度参数、不同接毒剂量与病毒增殖的相关性进行研究。确定牛细小病毒NB1202株、牛病毒性腹泻病毒NM0901株在3L转瓶培养过程中的最适培养温度参数和病毒接种量。通过甲醛灭活验证试验,确定甲醛灭活最适宜浓度为0.7mg/ml。通过铝佐剂剂量的筛选试验,确定氢氧化铝佐剂的最佳用量为1mg/ml。通过上述实验研究,优化了牛病毒性腹泻-细小病毒病二联疫苗的制备工艺。本研究在疫苗安全性评价方面,同时使用SPF级小鼠法和豚鼠法进行牛病毒性腹泻-牛细小病毒病二联疫苗牛病毒性腹泻疫苗的安全检查。结果证明本研究制备的疫苗安全性符合要求。在疫苗有效性评价方面,本研究建立了一种SPF级小鼠法检测牛病毒性腹泻-细小病毒病二联疫苗效力方法。该方法是以白喉疫苗效力试验(Vero细胞法)为基础,建立了用于牛病毒性腹泻-牛细小病毒病二联疫苗效力检测。该方法的优点在于,以抗体检测代替了动物攻毒试验,具有较高的准确性和稳定性。牛病毒性腹泻-牛细小病毒病二联疫苗免疫原性进行评价结果显示:牛病毒性腹泻疫苗原液效价可达到1:80,牛细小病毒病疫苗原液效价可达到1:160,表明疫苗具有良好的保护性。上述研究成果对我国牛病毒性腹泻、牛细小病毒病的防控提供了科学的实验数据,并奠定良好的技术基础。
【关键词】：牛病毒性腹泻病毒 牛细小病毒 病毒分离 疫苗生产工艺 疫苗安全性 疫苗免疫原性
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.4
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-9
• 英文缩写词表9-12
• 第一篇 文献综述12-24
• 第一章 牛病毒性腹泻研究进展12-18
• 1 牛病毒性腹泻病原学研究进展12-14
• 2 牛病毒性腹泻流行病学14-16
• 3 牛病毒性腹泻疫苗的研究进展16-18
• 第二章 牛细小病毒病研究进展18-22
• 1 牛细小病毒病病原学18-20
• 2 牛细小病毒病的流行病学20-22
• 第三章 研究目的与意义22-24
• 第二篇 实验研究24-75
• 第一章 牛细小病毒分离鉴定24-31
• 1 材料24-25
• 2 方法25-27
• 3 结果27-30
• 4 讨论30
• 5 小结30-31
• 第二章 牛病毒性腹泻-细小病毒病二联疫苗毒种种子批的检定31-46
• 1 材料31-33
• 2 方法33-37
• 3 结果37-45
• 4 讨论45
• 5 小结45-46
• 第三章 牛细小病毒、牛病毒性腹泻病毒在不同细胞中的复制动力学的研究46-55
• 1 材料46-47
• 2 方法47-49
• 3 结果49-53
• 4 讨论53-54
• 5 小结54-55
• 第四章 牛病毒性腹泻-细小病毒病二联疫苗的生产工艺研究55-70
• 1 材料55-57
• 2 方法57-61
• 3 结果61-67
• 4 讨论67-68
• 5 小结68-70
• 第五章 牛病毒性腹泻-细小病毒病二联疫苗安全性和免疫原性评价70-75
• 1 材料70-71
• 2 方法71-73
• 3 结果73
• 4 讨论73-74
• 5 小结74-75
• 结论75-76
• 参考文献76-86
• 导师简介86-88
• 作者简介88-89
• 致谢89

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