猪全基因组CRISPR/Cas9敲除文库的构建及筛选病毒抗性关键宿主因子

发布时间：2021-08-22 03:51

　　养猪业中多种传染性疾病严重影响着猪的育种进程和生产效益,带来了巨大的经济损失。如何防治病毒感染和传播是近些年来一直被关注的热点问题。常规的疫苗接种和药物的长期使用,使得具有较强变异能力的病毒进行不断变异,最终导致病毒防治变得更加困难,因此无法从根本上解决病毒的传播。利用遗传手段修饰宿主关键基因,通过抗病育种策略培育抗病猪是预防疾病传播的一种有效方法,也是目前的研究热点,如现有的抗蓝耳病猪和抗猪瘟病毒猪都达到了良好的抗病效果。这种方法最关键的是寻找宿主体内有效的抗病基因,然而已知的有效基因很少,如何去挖掘更多的有效基因给科研工作者带来了极大的挑战。近几年,快速发展的基因组编辑技术CRISPR/Cas9能够从分子、细胞或胚胎水平对细胞或个体进行操控。CRISPR高通量筛选结合基因功能缺失能够有效地挖掘病毒抗性的关键基因。选择活性高和脱靶低的sg RNA对CRISPR高通量筛选的准确性至关重要。因此,本研究首先探讨了sg RNA的活性和特异性,对长度分别为17、18、19和20 nts的sg RNA活性和特异性进行了评估。软件预测发现长度为20 nts的sg RNA潜在的脱靶位点数量最少,因... 

【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校

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【学位级别】：博士

【部分图文】：

CRISPR系统在适应性免疫中的机制（Hsuetal.2014）

华中农业大学2019届博士研究生学位（毕业）论文4构域切割，导致双链断裂(Double-StrandedBreak,DSB)（Gasiunasetal.2012）（图1-2）。为了更加便于应用CRISPR/Cas9系统，研究人员开发了一种嵌合的guideRNA(gRNA)，同时含有crRNA和tracrRNA的所有必需序列，从而简化了CRISPR/Cas9的操作系统（Jineketal.2012）。图1-2CRISPR/Cas9介导的DNA切割原理（Zhangetal.2014）Fig.1-2SchematicofCRISPR/Cas9-mediatedDNAcleavage.CRISPR/Cas9产生DSB会激发细胞DNA修复过程，主要包括非同源末端连接(Non-HomologousEndJoining,NHEJ)（DerianoandRoth2013）介导的DNA修复和同源重组(Homology-DirectedRepair,HDR)介导的DNA精准修复（HartlerodeandScully2009）。NHEJ介导的DNA损伤修复能够使断开的双链连接在一起，并在断裂位点处产生小的插入(Insertion)和缺失(Deletion)突变(Indels)（Jineketal.2013,Congetal.2013）。这些Indels突变能够破坏和废除靶基因或基因组重要元件的功能，借助这个功能研究人员制备了多种遗传修饰动物个体（Crispoetal.2015,HashimotoandTakemoto2015,Wangetal.2015b,Wangetal.2016,Ikedaetal.2017）。HDR介导的DNA精准修复需要含有同源供体DNA序列作为修复模板。因此，比NHEJ介导的DNA修复复杂的多（JamesM.Daley2013,Wangetal.2015a）（图1-3）。基因组的精准修复，如点突变、编码区(CodingDNASequence,CDS)替换、报告基因

CRISPR诱导的NHEJ和HDR（Guitartetal.2016）


本文编号：3356943