N25改变碳酸钙形貌的机理及框架蛋白分布模式的研究
发布时间：2021-08-26 01:01
合浦珠母贝（Pinctada fucata）是研究贝类矿化机理的研究物种之一,其珍珠层具有优良的性能而受到关注,对于贝壳形成原理的探索是本领域的研究热点之一。在之前的研究中通过基因芯片测定不同发育时期各基因转录水平的高低,结合基质蛋白特征筛选出若干基质蛋白候选基因,它们的具体功能还需要深入研究。本研究选取其中的一个unigene进行克隆和功能鉴定,命名为mantle protein N25（简称N25）,论文首先深入分析了N25蛋白的功能和影响矿化的机理。通过RACE克隆获得了N25基因的全长,检测到该基因在外套膜组织中特异性表达。本研究使用原核表达纯化难溶性基质蛋白N25的包涵体,再利用蛋白质重折叠获得了具有活性的可溶性蛋白,初步建立一种通过包涵体复性获得难溶性基质蛋白的方案。纯化获得的N25蛋白具有结合方解石、文石和几丁质的能力。贝壳组分的免疫印迹显示N25蛋白分布于棱柱层和珍珠层的不可溶性组分。N25蛋白对方解石和文石的结晶形貌都有明显的影响,我们使用结构光照明显微镜对Cy5标记的N25在方解石上的分布进行了成像定位,结果显示N25蛋白只分布在晶体表面而不进入晶体内部。借助软件计...
【文章来源】：清华大学北京市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：120 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
生物诱导矿化示意图(Mann,2001)
第1章前言5如图1.2A，B所示，生物控制矿化一般按照发生的部位可以分为细胞内矿化和细胞外矿化两大方式(Mann,2001)。胞内矿化，通常是先形成胞内的特定腔室作为矿化发生场所，细小的矿物晶体首先在这些细胞器中形成，进而通过囊泡等方式被运输到接近细胞膜表面，再由胞吐过程被分泌出去到达特定的矿化位点发挥作用。细胞外矿化则是细胞将矿化的原料输出到细胞外，达到一定的阈值之后开始发生生物诱导的化学沉积矿化，例如基质蛋白的分泌诱导了贝壳、骨针等结构的有序沉积矿化。无论是哪一种方式，两者都受到了严格的调控。而且两类过程都需要大量蛋白的直接参与，主要的不同点在于，细胞外矿化输送的是矿化的原材料，细胞内则几乎是预先形成半成品。图1.2生物控制矿化过程示意图(Mann,2001)A：胞外矿化；B：胞内矿化。生物控制矿化有两类主要途径，分别是胞外矿化和胞内矿化。相似的地方是，两类过程终产物都有胞外基质的调节，主要区别是分泌的囊泡中的物质是离子还是固定化的离子。胞外矿化中，有机分子和离子先分泌至胞外，之后有机大分子调控无机离子沉积形成特定的结构。胞内矿化则是在胞内的离子先形成体积较小的晶体，然后被运输到胞外，接着受到有机分子进一步调控形成矿化结构。小晶体的聚合沉积过程往往更加复杂一些，这一过程涉及到了晶体形貌发生、结构成型、矿化促进与抑制因子的调节。此外，晶体的特定方向的生长和沉积受到胞外有机分子的精密调控。Excretion，分泌；vesicles，囊泡；organics，有机质；morphgenesis，晶貌；tectonics，构造；promotor，促进因子；inhibitors，抑制因子；orientedmineralgrowth，固定朝向的生长。
第1章前言10的形态，进而对于珍珠层的正常发育和沉积起到重要调控作用(Suzukietal.,2009)。图1.3Pif蛋白的RNA干扰与文石片层异常沉积(Suzukietal.,2009)针对Pif基因的dsRNA注射对于基因表达量和贝壳形态的影响。图A，注射各种浓度的dsRNA后Pif的基因的相对表达量，PBS组仅注射PBS缓冲液，GFP组注射相同浓度的针对GFP基因的dsRNA，Pif5、Pif15、Pif30分别是注射5、15、30μg针对Pif基因的dsRNA；B，注射PBS缓冲液的对照组，珍珠层内表面的扫描电镜成像；C，注射30μgPif基因的dsRNA，珍珠层内表面的扫描电镜成像；D，注射PBS缓冲液之后，将对照组的贝在锶海水（高浓度）培养一天，之后用正常海水彻底置换锶海水并继续培养六天，将贝壳制样后用透射电镜对断面成像，箭头所指的线是锶元素形成的，圆圈内进行了元素分析验证；E，注射30μgPif基因的dsRNA并做相同处理的实验组贝壳珍珠层断面的透射电镜成像。同样，圆圈内用元素分析检测到了高浓度锶元素。B，C标尺：10μm；D，E标尺：2μm。有越来越多的基质蛋白相继利用各种手段被鉴定出来，研究者发现有一些基质蛋白具有相似的特征，而另一些则差异较大。这与预期是相符的，矿化结构的多样性和复杂性侧面反映出其对应的调控蛋白也很可能是复杂多样的。根据已有研究，基质蛋白可以简单按照理化性质和氨基酸特征进行分类统计，此外还需要结合基质蛋白在贝壳的不同矿化结构中的分布、等电点差异等信息。按照这一分类标准，我们可以简要将基质蛋白分为以下几类：1）酸性基质蛋白。主要的代表性蛋白有Caspartin(Marinetal.,2005),Aspein(Tsukamotoetal.,2004)、Asp-rich(Shinetal.,2000)家族的蛋白、MSP-1(SarashinaandEndo,2001)、MSP-2(HasegawaandUchiyama,2005)、Prismalin-14(Suzukietal.,2004
本文编号：3363226
【文章来源】：清华大学北京市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：120 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
生物诱导矿化示意图(Mann,2001)
第1章前言5如图1.2A，B所示，生物控制矿化一般按照发生的部位可以分为细胞内矿化和细胞外矿化两大方式(Mann,2001)。胞内矿化，通常是先形成胞内的特定腔室作为矿化发生场所，细小的矿物晶体首先在这些细胞器中形成，进而通过囊泡等方式被运输到接近细胞膜表面，再由胞吐过程被分泌出去到达特定的矿化位点发挥作用。细胞外矿化则是细胞将矿化的原料输出到细胞外，达到一定的阈值之后开始发生生物诱导的化学沉积矿化，例如基质蛋白的分泌诱导了贝壳、骨针等结构的有序沉积矿化。无论是哪一种方式，两者都受到了严格的调控。而且两类过程都需要大量蛋白的直接参与，主要的不同点在于，细胞外矿化输送的是矿化的原材料，细胞内则几乎是预先形成半成品。图1.2生物控制矿化过程示意图(Mann,2001)A：胞外矿化；B：胞内矿化。生物控制矿化有两类主要途径，分别是胞外矿化和胞内矿化。相似的地方是，两类过程终产物都有胞外基质的调节，主要区别是分泌的囊泡中的物质是离子还是固定化的离子。胞外矿化中，有机分子和离子先分泌至胞外，之后有机大分子调控无机离子沉积形成特定的结构。胞内矿化则是在胞内的离子先形成体积较小的晶体，然后被运输到胞外，接着受到有机分子进一步调控形成矿化结构。小晶体的聚合沉积过程往往更加复杂一些，这一过程涉及到了晶体形貌发生、结构成型、矿化促进与抑制因子的调节。此外，晶体的特定方向的生长和沉积受到胞外有机分子的精密调控。Excretion，分泌；vesicles，囊泡；organics，有机质；morphgenesis，晶貌；tectonics，构造；promotor，促进因子；inhibitors，抑制因子；orientedmineralgrowth，固定朝向的生长。
第1章前言10的形态，进而对于珍珠层的正常发育和沉积起到重要调控作用(Suzukietal.,2009)。图1.3Pif蛋白的RNA干扰与文石片层异常沉积(Suzukietal.,2009)针对Pif基因的dsRNA注射对于基因表达量和贝壳形态的影响。图A，注射各种浓度的dsRNA后Pif的基因的相对表达量，PBS组仅注射PBS缓冲液，GFP组注射相同浓度的针对GFP基因的dsRNA，Pif5、Pif15、Pif30分别是注射5、15、30μg针对Pif基因的dsRNA；B，注射PBS缓冲液的对照组，珍珠层内表面的扫描电镜成像；C，注射30μgPif基因的dsRNA，珍珠层内表面的扫描电镜成像；D，注射PBS缓冲液之后，将对照组的贝在锶海水（高浓度）培养一天，之后用正常海水彻底置换锶海水并继续培养六天，将贝壳制样后用透射电镜对断面成像，箭头所指的线是锶元素形成的，圆圈内进行了元素分析验证；E，注射30μgPif基因的dsRNA并做相同处理的实验组贝壳珍珠层断面的透射电镜成像。同样，圆圈内用元素分析检测到了高浓度锶元素。B，C标尺：10μm；D，E标尺：2μm。有越来越多的基质蛋白相继利用各种手段被鉴定出来，研究者发现有一些基质蛋白具有相似的特征，而另一些则差异较大。这与预期是相符的，矿化结构的多样性和复杂性侧面反映出其对应的调控蛋白也很可能是复杂多样的。根据已有研究，基质蛋白可以简单按照理化性质和氨基酸特征进行分类统计，此外还需要结合基质蛋白在贝壳的不同矿化结构中的分布、等电点差异等信息。按照这一分类标准，我们可以简要将基质蛋白分为以下几类：1）酸性基质蛋白。主要的代表性蛋白有Caspartin(Marinetal.,2005),Aspein(Tsukamotoetal.,2004)、Asp-rich(Shinetal.,2000)家族的蛋白、MSP-1(SarashinaandEndo,2001)、MSP-2(HasegawaandUchiyama,2005)、Prismalin-14(Suzukietal.,2004
本文编号：3363226
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