大环内酯类药物对S.suis体外生物被膜QS系统及毒力因子的影响

发布时间：2017-05-12 01:09

  本文关键词：大环内酯类药物对S.suis体外生物被膜QS系统及毒力因子的影响，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：猪链球菌是引起猪脑膜炎、败血症、心内膜炎、关节炎、肺炎等威胁生命疾病的重要病原。目前国内外学者认为,猪链球菌在动物体内外可以形成生物被膜(biofilm,BF),细菌生物被膜(bacterial biofilm)是细菌利用自身分泌的含水聚合物质粘附成团,附着于固体物质表面的具有特殊微结构的细菌群落。近年来,细菌对抗生素的耐药现象日益严重,随着对生物膜研究的深入,发现细菌对抗生素的耐药性不仅与耐药菌株的大量产生有关,亦与致病菌在体内形成生物膜有关。当细菌在体内形成生物膜后,细菌群体耐药性极强,不仅可以逃避宿主免疫作用,且感染部位难以彻底清除,是临床上难治性感染的重要原因之一。生物被膜作为细菌的一种重要生存方式,受多种因素的影响和调节。其中,密度体感应(quorum sensing,QS)现象就是近年来发现的对生物被膜产生重要作用的影响因素之一。大环内酯类药物(Macrolides)在体外亚-MIC浓度下显示了对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)等生物被膜形成的抑制作用,但尚未有关于亚-MIC大环内酯类抗菌药物对猪链球菌生物被膜形成的影响及其调控机制的研究,故在本研究中,利用卡尔加里生物被膜装置(CBD)成功的获得了猪链球菌体外生物被膜,采用扫描电镜和微孔板结晶紫染色法从定性和定量两个角度阐明亚-MIC浓度的三种大环内酯类药物(红霉素、阿奇霉素、泰乐菌素)对猪链球菌ATCC700794生物被膜的影响。通过蛋白质组学i TRAQ技术分析1/4MIC大环内酯类药物(红霉素、阿奇霉素、泰乐菌素)干预猪链球菌生物被膜形成前后差异蛋白,寻找大环内酯类药物作用的蛋白靶点,并通过Real time RT-PCR技术检测群体感应有关的差异蛋白的基因及猪链球菌毒力基因的变化,从分子水平验证大环内酯类药物对密度感应系统相关蛋白和毒力基因的影响。说明群体感应系统、生物被膜形成和毒力因子之间的关系,为临床治疗生物被膜感染提供理论依据。研究的主要结果如下:(1)通过卡里加里生物被膜装置(CBD)成功获得的猪链球菌体外生物被膜,扫描电镜和结晶紫染色鉴定了生物被膜形成周期,其在72h时处于成熟期。(2)亚-MIC大环内酯类药物(红霉素、阿奇霉素、泰乐菌素)干预猪链球菌生物被膜形成,结晶紫染色进行生物被膜定量分析,结果显示在1/2和1/4MIC浓度时对生物被膜干预效果明显。(3)通过蛋白质组学i TRAQ技术,对1/4MIC浓度的大环内酯类药物(红霉素、阿奇霉素、泰乐菌素)干预的猪链球菌生物被膜形成进行蛋白质组定量分析,按ratio1.2 or0.8(p-value0.05)进行蛋白质筛选,结果显示红霉素干预后,上调蛋白55个,下调蛋白24个;阿奇霉素干预后,上调蛋白82个,下调蛋白92个;泰乐菌素干预后,上调蛋白105个,下调蛋白66个。与群体感应系统有关膜蛋白ABC superfamily ATP binding cassette transporter(基因com AB编码)均表达上调。(4)通过Real time RT-PCR方法比较1/4MIC红霉素、阿奇霉素、泰乐菌素干预下的猪链球菌QS系统相关基因com AB及毒力基因的表达。亚-MIC红霉素干预猪链球菌生物被膜形成后,QS系统中com AB及毒力基因中gdh、fbps、ef表达上调,cps表达下调,其他基因表达无差异。亚-MIC阿奇霉素干预猪链球菌生物被膜形成后,QS系统中com AB及毒力基因中cps、mrp、ef表达上调,gdh、sly表达下调,其他基因表达无差异。亚-MIC泰乐菌素抑制猪链球菌生物被膜形成后,QS系统中com AB表达上调,毒力基因gdh、sly、cps、gapdh、fbps、mrp和ef表达下调。提示密度感应系统与毒力基因有一定的相关性。本课题研究结果显示,大环内酯类药物(红霉素、阿奇霉素、泰乐菌素)在亚-MIC浓度下,对猪链球菌ATCC700794生物被膜的形成具有干预作用,其对猪链球菌密度感应系统、生物被膜和毒力基因有一定的影响。说明密度感应系统、生物被膜形成和毒力基因有一定的相关性。目前对亚-MIC抗菌药物对细菌生物被膜和毒力因子的调控还知之甚少,尚有许多未知的作用存在,因此,本研究进行大量相关的实验室研究,可为临床抗菌药物在使用时趋利避害,合理应用提供有价值的参考,也可通过细菌生物被膜相关调控机制的研究,为有效地防控细菌生物被膜感染提供有力的帮助。
【关键词】：猪链球菌生物被膜 QS系统 毒力因子 大环内酯类药物 i TRAQ
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S859.79
【目录】：

• 摘要8-10
• 英文摘要10-13
• 1 引言13-27
• 1.1 细菌生物被膜研究进展13-18
• 1.1.1 生物被膜的结构与特征14-15
• 1.1.2 细菌生物被膜的形成及致病15-17
• 1.1.3 细菌生物被膜的耐药性与防治17-18
• 1.2 猪链球菌2型的毒力因子18-20
• 1.3 细菌的QS系统对生物被膜的影响20-21
• 1.4 大环内酯类药物的研究进展21-24
• 1.4.1 对粘附的抑制作用22
• 1.4.2 对毒力因子的抑制作用22
• 1.4.3 对生物被膜的抑制作用22-23
• 1.4.4 对群体感应的抑制23-24
• 1.5 细菌生物被膜实验方法的研究进展24-25
• 1.5.1 生物被膜模型24
• 1.5.2 细菌生物被膜的鉴定方法24-25
• 1.6 研究目的与意义25-27
• 2 材料和方法27-36
• 2.1 材料27-29
• 2.1.1 菌株27
• 2.1.2 药品27
• 2.1.3 培养基及试剂27
• 2.1.4 仪器设备27-28
• 2.1.5 Real time RT-PCR所需引物28-29
• 2.2 方法29-36
• 2.2.1 猪链球菌生物被膜形成及其测定29-30
• 2.2.2 大环内酯类药物对猪链球菌抗菌活性的研究30-31
• 2.2.3 大环内酯类药物对猪链球菌生物被膜形成的干预作用31
• 2.2.4 样品制备31-32
• 2.2.5 酶解和肽段定量32
• 2.2.6 肽段标记32
• 2.2.7 SCX分级32
• 2.2.8 质谱分析32-33
• 2.2.9 数据分析33-34
• 2.2.10 细菌RNA提取及Real time RT-PCR34-35
• 2.2.11 数据分析采用35-36
• 3 结果与分析36-63
• 3.1 生物被膜形成能力的测定36
• 3.2 猪链球菌生物被膜的超微结构36-37
• 3.3 大环内酯类药物对猪链球菌生物被膜形成的干预作用37-39
• 3.4 亚抑菌浓度大环内酯类药物干预生物被膜形成蛋白质组学结果39-60
• 3.4.1 蛋白质定量结果39
• 3.4.2 SDS-PAGE电泳39-40
• 3.4.3 酶解肽段浓度测定40
• 3.4.4 肽段SCX分级40-41
• 3.4.5 生物信息学分析41-44
• 3.4.6 蛋白质组学分析44-45
• 3.4.7 三组差异蛋白的详细信息45-60
• 3.4.8 QS系统蛋白质组学分析60
• 3.5 QS系统及毒力相关基因的体外定量分析60-63
• 4 讨论63-71
• 4.1 生物被膜体外模型建立63
• 4.2 生物被膜形成的鉴定63-64
• 4.3 大环内酯类药物对生物被膜形成的影响64
• 4.4 亚-MIC浓度的大环内酯类药物干预猪链球菌生物被膜形成蛋白质组学分析64-67
• 4.4.1 红霉素干预猪链球菌生物被膜形成的差异蛋白64-66
• 4.4.2 阿奇霉素干预猪链球菌生物被膜形成的差异蛋白66-67
• 4.4.3 泰乐菌素干预猪链球菌生物被膜形成的差异蛋白67
• 4.5 大环内酯类药物对猪链球菌QS系统及生物被膜的影响67-68
• 4.6 亚MIC大环内酯类药物对S. suis毒力因子的影响68-71
• 5 结论71-72
• 致谢72-73
• 参考文献73-83
• 附录83-103
• 攻读博士学位期间发表的学术论文103

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