Myostatin蛋白功能性失活小鼠模型的建立与相关研究

发布时间：2017-05-13 16:16

  本文关键词：Myostatin蛋白功能性失活小鼠模型的建立与相关研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：Myostatin是骨骼肌生长的负调控因子,myostatin功能性失活可以显著提高动物的生长速度和产肉率,因此它是家畜基因工程育种中的重要候选基因。在小鼠等物种的研究表明,有两种方式可以有效灭活myostatin功能而产生肌肉过度生长的表型：一种是通过转基因技术在动物体内过表达myostatin的抑制蛋白,如myostatin前肽；另一种方式是通过基因敲除技术剔除myostatin基因。绵羊是畜牧生产中的主要家畜之一,其肉、毛是极其重要的经济性状,利用基因工程手段改良其肉用表型对培育优质绵羊新品种具有重要实际意义。因此,本论文以小鼠模型研究了过表达绵羊myostatin前肽和敲除myostatin基因对小鼠肌肉生长等表型的影响,为今后绵羊的基因工程育种提供依据和参考。主要研究结果如下： 1.在转基因小鼠体内过表达绵羊myostatin前肽 首先通过实验克隆获得了绵羊]myostatin前肽的cDNA序列,并对序列进行了点突变以增强其抑制功能。首先通过A204细胞体外实验证明,过表达的绵羊]myostatin前肽可以有效降低细胞内源性myostatin活性,然后通过小鼠体内质粒注射实验证实,肌肉内注射绵羊myostatin前肽表达质粒可以诱发体重增加和肌纤维肥大的表型。在此基础上,构建四环素可诱导的、肌肉特异性表达绵羊myostatin前肽基因的载体,并生产了转基因小鼠。该诱导载体在体外细胞和转基因小鼠体内均能实现依赖于四环素的可诱导表达模式,且表达严谨性和组织特异性效果很好。之后检验了转基因小鼠的肌肉生长表型,发现诱导表达myostain前肽不能产生体重增加和肌重增加的表型,但可以诱导肌纤维肥大的表型。由此,通过上述实验证实了通过可控的myostatin前肽过表达可以在哺乳动物体内引发myostatin功能性失活,这对于将其应用到绵羊基因工程育种中提供了有价值的参考。 2.敲除小鼠的myostatin基因 首先利用最新发展起来的CRISPR/Cas9系统对小鼠myostatin基因进行了敲除,同时还一次性敲除了另一个与毛发生长相关的基因—成纤维细胞生长因子5(FGF5)。首先通过多物种的序列比对,在myostatin和fgf5基因的高度保守区域选择靶位点并设计了sgRNA,然后通过原核显微注射生产了：myostatin和fgt3突变小鼠,结果表明,出生的小鼠中双基因敲除效率达到20%,且没有明显脱靶效应。随后通过对基因敲除小鼠的表型进行了分析,结果表明,敲除myostatin的小鼠表现出体重增加和肌肉过度生长等表型；敲除fgf5的小鼠表现出被毛过度生长的表型。Myostatin/fgf5同时敲除的小鼠也表现出与单个基因敲除类似的表型,但myostatin/fgf5同时敲除的小鼠幼年期体型偏小且存活率较低。进一步研究发现,myostatin和fgt3基因间存在相互影响,在双突变的情况下可能会影响小鼠出生后的生长发育或体内能量代谢。本研究表明,利用CRISPR/Cas9系统同时敲除myostatin和fgf5基因的方案是高效并可行的,这为绵羊等家畜的基因敲除并进而改良绵羊肉、毛表型提供了借鉴。 综上,本论文利用转基因和基因敲除两种技术在两种小鼠模型上分别评估了绵羊myostatin前肽和myostatin/fgf5敲除对肌肉生长等表型的影响,研究结果为这些技术今后应用于绵羊等家畜的基因工程育种奠定了技术基础和提供了理论依据。
【关键词】：绵羊 myostatin 转基因 可诱导表达 CRISPR/Cas9 FGF5 基因敲除
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S826
【目录】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-7
• 目录7-8
• ~.略语表8-9
• 第一章 引言9-37
• 第一节 Myostatin基因的研究进展9-18
• 第二节 FGF5基因的研究进展18-20
• 第三节 转基因与基因打靶20-26
• 第四节 新的基因修饰技术26-37
• 第二章 研究报告37-91
• 第一部分 绵羊myostatin前肽的组织特异性可诱导表达小鼠模型的建立及相关研究37-66
• 1 引言37
• 2 材料与方法37-54
• 3 实验结果与分析54-64
• 4 讨论64-66
• 第二部分 Myostatin和FGF5双基因敲除小鼠模型的建立与相关研究66-91
• 1 引言66
• 2 材料与方法66-76
• 3 实验结果与分析76-89
• 4 讨论89-91
• 第三章 结论91-92
• 参考文献92-109
• 致谢109-110
• 作者简历110

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 ;Efficient and Specific Modifications of the Drosophila Genome by Means of an Easy TALEN Strategy[J];遗传学报;2012年05期

2 Charles Ashton;;Rapid and Cost-Effective Gene Targeting in Rat Embryonic Stem Cells by TALENs[J];遗传学报;2012年06期

  本文关键词：Myostatin蛋白功能性失活小鼠模型的建立与相关研究，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：363020