宿主细胞蛋白STAT5、NPM1和DNAJB6在PCV2复制过程中作用及机制研究

发布时间：2022-02-22 03:51

　　猪圆环病毒2型（porcine circovirus type,PCV2）引起猪圆环病毒相关疾病（porcine circovirus-associated diseases,PCVDs）,PCV2感染首先侵害机体的免疫系统,引起机体产生免疫抑制从而对多种病原易感,导致感染猪群病死率显著升高,生产性能明显下降,给养猪业造成巨大的经济损失。PCV2基因组包含11个重叠的开放阅读框（ORFs）,其中最重要的是ORF2,ORF2编码的衣壳蛋白Cap是PCV2的唯一结构蛋白,在病毒复制过程中,Cap参与了病毒基因组的入核以及成熟病毒粒子的组装。信号传导及转录激活蛋白5（signal transducer and activator of transcription5,STAT5）是一种多功能的转录因子,具有与DNA结合的特性。核仁磷酸蛋白1（nucleophosmin 1,NPM1）是一种多功能的宿主蛋白,不仅参与多种细胞生理活动,还在多种病毒的复制过程中发挥重要作用。热休克蛋白40 B6（heat shock protein40 B6,DNAJB6）属于热休克蛋白40（Hsp40）家族成员之... 

【文章来源】：西北农林科技大学陕西省211工程院校985工程院校教育部直属院校

【文章页数】：143 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
主要符号对照表
文献综述
    第一章 动物病毒与宿主细胞蛋白互作研究进展
        1.1 宿主细胞蛋白在动物病毒复制过程中作用及机制
            1.1.1 NPM蛋白家族
            1.1.2 Hsp家族成员
            1.1.3 组蛋白分子伴侣
            1.1.4 MCM家族成员
            1.1.5 STAT家族成员
            1.1.6 TRIM家族成员
            1.1.7 波形蛋白
        1.2 PCV2与宿主细胞蛋白互作研究进展
            1.2.1 PCV2与宿主细胞蛋白互作在病毒吸附和入胞过程中作用与机制
            1.2.2 PCV2与宿主细胞蛋白互作在病毒入核和复制过程中作用与机制
            1.2.3 PCV2与宿主细胞蛋白互作在病毒出核及出胞过程中作用与机制
        1.3 本研究的目的意义
试验研究
    第二章 PCV2 Cap宿主细胞互作蛋白筛选与鉴定
        2.1 材料
            2.1.1 细胞、病毒及菌株
            2.1.2 载体及主要试剂
            2.1.3 仪器设备
        2.2 方法
            2.2.1 PCV2 Cap宿主细胞互作蛋白的筛选
            2.2.2 stat5克隆及真核表达载体的构建
            2.2.3 npm1克隆及真核表达载体的构建
            2.2.4 dnajb6克隆及真核表达载体的构建
            2.2.5 不同种属来源的STAT5、NPM1及DNAJB6 序列比对
            2.2.6 激光共聚焦检测STAT5、NPM1及DNAJB6 亚细胞定位
            2.2.7 试验动物及分组设计
            2.2.8 STAT5、NPM1、DNAJB6的m RNA水平检测
            2.2.9 组织STAT5、NPM1、DNAJB6 表达情况检测
            2.2.10 数据分析
        2.3 结果
            2.3.1 PCV2 Cap宿主互作蛋白的筛选与鉴定
            2.3.2 stat5克隆及真核表达载体的构建与鉴定
            2.3.3 npm1克隆及真核表达载体的构建与鉴定
            2.3.4 dnajb6克隆及真核表达载体的构建与鉴定
            2.3.5 STAT5序列比对分析
            2.3.6 NPM1序列比对分析
            2.3.7 DNAJB6序列比对分析
            2.3.8 STAT5在PCV2 感染细胞中的亚细胞定位
            2.3.9 NPM1在PCV2 感染细胞中的亚细胞定位
            2.3.10 DNAJB6在PCV2 感染细胞中的亚细胞定位
            2.3.11 STAT5在PCV2 感染猪组织中的表达量变化
            2.3.12 NPM1在PCV2 感染猪组织中的表达变化
            2.3.13 DNAJB6在PCV2 感染猪组织中的表达变化
        2.4 讨论
        2.5 小结
    第三章 宿主细胞蛋白STAT5在PCV2 复制过程中作用及机制
        3.1 材料
            3.1.1 细胞、病毒及菌种
            3.1.2 载体、主要试剂
            3.1.3 仪器设备
        3.2 方法
            3.2.1 stat5原核表达载体的构建
            3.2.2 免疫共沉淀检测Cap和 STAT5 的互作
            3.2.3 GST-pull down检测Cap和 STAT5 的互作
            3.2.4 干扰stat5 表达对PCV2 复制的影响
            3.2.5 DNA pull-down检测STAT5与PCV2 DNA互作区域
            3.2.6 PCV2 DNA结合活性缺失的PCV2 突变毒株构建与鉴定
            3.2.7 荧光原位杂交(FISH)检测突变毒株的复制情况
            3.2.8 荧光定量PCR检测突变毒株的DNA拷贝数
            3.2.9 数据分析
        3.3 结果
            3.3.1 STAT5原核表达载体的鉴定
            3.3.2 免疫共沉淀检测Cap与 STAT5 互作
            3.3.3 GST-pull down鉴定Cap和 STAT5 互作
            3.3.4 干扰stat5 表达显著抑制 PCV2 的复制
            3.3.5 PCV2突变毒株的构建与鉴定
            3.3.6 DNA pull down验证PCV2 DNA与 STAT5 互作区域
            3.3.7 突变毒株PCV2-MDS在细胞内的复制情况
        3.4 讨论
        3.5 小结
    第四章 宿主细胞蛋白NPM1在PCV2 复制过程中作用及机制
        4.1 材料
            4.1.1 细胞、病毒及菌株
            4.1.2 载体和主要试剂
            4.1.3 仪器设备
        4.2 方法
            4.2.1 干扰npm1 表达对PCV2 复制影响
            4.2.2 干扰npm1 表达对PCV2 Cap表达影响
            4.2.3 利用CRISPR/Cas9 系统敲除PK-15中npm1
            4.2.4 NPM1及截短体原核表达载体的构建
            4.2.5 Cap及截短体真核表达载体的构建
            4.2.6 GST-pull down检测Cap及其截短体与NPM1 的互作
            4.2.7 NPM1 结合活性缺失的PCV2 突变毒株的构建与鉴定
            4.2.8 荧光定量PCR检测PCV2 突变毒株的复制水平
            4.2.9 荧光原位杂交(FISH)检测突变毒株的复制情况
        4.3 结果
            4.3.1 干扰npm1对Cap表达和PCV2 DNA复制影响
            4.3.2 npm1敲除的 PK-15 建立与鉴定
            4.3.3 GST-pull down 检测 Cap、NPM1 以及 STAT5 之间的互作
            4.3.4 NPM1及截短体原核表达载体的构建与鉴定
            4.3.5 Cap及截短体真核表达载体的构建与鉴定
            4.3.6 GST-pull down确定NPM1与Cap互作区域
            4.3.7 NPM1 结合活性缺失的PCV2 突变毒株构建与鉴定
            4.3.8 PCV2 突变毒株PCV2-Nm A复制水平
        4.4 讨论
        4.5 小结
    第五章 宿主细胞蛋白DNAJB6在PCV2 复制过程中作用及机制
        5.1 材料
            5.1.1 细胞、病毒及菌株
            5.1.2 载体和主要试剂
            5.1.3 仪器设备
        5.2 方法
            5.2.1 荧光定量PCR检测PCV2 拷贝数
            5.2.2 western blotting检测DNAJB6和Cap的表达
            5.2.3 间接免疫荧光检测Cap及 DNAJB6 的定位情况
            5.2.4 免疫共沉淀检测Cap与 DNAJB6 的互作
            5.2.5 DNAJB6及截短体原核表达载体的构建
            5.2.6 Cap截短体真核表达载体的构建
            5.2.7 DNAJB6突变体真核表达载体的构建
            5.2.8 DNAJB6及截短体原核表达及纯化鉴定
            5.2.9 GST-pull down检测Cap及 DNAJB6 的互作
            5.2.10 激光共聚焦检测PCV2及PCV2 Cap诱导的自噬小体
            5.2.11 相对荧光定量PCR检测DNAJB6的m RNA水平
            5.2.12 利用si RNA干扰atg5 的表达
            5.2.13 抑制试验
            5.2.14 数据分析
        5.3 结果
            5.3.1 PCV2 感染上调PK-15中DNAJB6 的表达
            5.3.2 DNAJB6与PCV2 Cap共定位
            5.3.3 DNAJB6与PCV2 Cap的互作
            5.3.4 DNAJB6全长及截短体原核表达载体的构建与鉴定
            5.3.5 Cap截短体真核表达载体的构建与鉴定
            5.3.6 鉴定DNAJB6与Cap的互作区域
            5.3.7 dnajb6敲除的 PK-15 细胞鉴定
            5.3.8 dnajb6敲除抑制自噬小体的形成和病毒复制
            5.3.9 DNAJB6过表达促进自噬体的形成和病毒复制
            5.3.10 DNAJB6与Cap的互作促进自噬体的形成
            5.3.11 DNAJB6与Cap的互作通过增强自噬促进PCV2 复制
        5.4 讨论
        5.5 小结
结论
创新点
参考文献
附录
致谢
个人简介


【参考文献】：
期刊论文
[1]糖皮质激素对高氧诱导的新生小鼠肺功能损伤、炎症反应和JAK2/STAT5通路的影响[J]. 刘露,冯伟,郭轶男.  实验动物科学. 2020(01)
[2]TRIM21在病毒诱导的天然免疫应答中的研究进展[J]. 赵琳琳,陈玮.  中国免疫学杂志. 2020(16)
[3]TRIMs家族蛋白在肝细胞癌中的研究进展[J]. 何志鑫,朱进,朱旭辉.  临床肿瘤学杂志. 2019(10)
[4]猪圆环病毒Ⅱ型蛋白功能研究进展[J]. 周玲玲,王英杰,张慢,林正丹,时志琪,马园园,宋玉伟.  今日畜牧兽医. 2019(09)
[5]TRIM21蛋白结构及其应答病原感染的研究进展[J]. 石钧戈,周作勇,王芝英.  中国预防兽医学报. 2019(04)
[6]PCV2 ORF1～ORF4基因所编码蛋白功能的研究进展[J]. 苏芮,王东亮,陈指龙,范秀军,邓治邦,杨青.  经济动物学报. 2020(01)
[7]NPM1 A型突变体对TGF-β1诱导K562细胞增殖及AKT磷酸化的影响[J]. 吴正财,王成艳,吴香新,许昌声,林敏辉.  中国肿瘤临床. 2019(04)
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[10]HSP70与病毒相互作用研究进展[J]. 尹玉伟,张培军,茆安婷,张腾月,郭曦尧,李月红.  中国兽医杂志. 2018(11)

博士论文
[1]p53调控IFITM3棕榈酰化修饰介导的抗日本脑炎病毒作用研究[D]. 武专昌.中国农业科学院 2015
[2]猪圆环病毒2的胞内运输机制研究[D]. 曹晶晶.浙江大学 2014

硕士论文
[1]VIP对PI3K/Akt信号通路的影响在DC细胞胃癌抗原提呈中的作用研究[D]. 桂冠.南昌大学 2014



本文编号：3638639