牛PLIN1基因转录调控机制及其对前体脂肪细胞增殖、分化和脂类代谢的作用研究
发布时间：2022-07-13 21:15
脂滴包被蛋白（perilipin,PLIN1）是一种在真核生物中由PLIN1基因编码的蛋白质。PAT家族是与脂滴表面蛋白相关的蛋白质家族。PLIN1的磷酸化对脂肪组织中脂肪代谢有重要作用,在脂肪细胞中调节脂肪分解和脂肪储存起重要作用。PLIN1包被在脂滴外层,可阻止体内脂肪酶进入脂滴,如激素敏感性脂肪酶（HSL）和脂肪甘油三酯脂肪酶（ATGL）。PLIN1基因对脂肪分解具有双向调控作用:基础状态下,PLIN1包被于脂滴表面,阻止脂肪酶接触到脂滴内的甘油三酯,从而抑制脂肪分解;能量需求增加时,c AMP-PKA信号通路被激活,PLIN1磷酸化促进脂解。为了探究牛PLIN1基因对牛脂肪细胞增殖分化和脂类代谢的调控作用,本研究以秦川肉牛初生犊牛前体脂肪细胞为实验材料,通过腺病毒介导过表达和干扰PLIN1基因的方法,来探讨PLIN1基因在调控牛前体脂肪细胞增殖分化过程及脂类代谢中作用,主要研究内容如下:1、PLIN1基因多态位点与秦川肉牛生长性状和肉质性状的关联分析检测PLIN1基因在秦川肉牛12个不同组织部位中的表达量,牛PLIN1基因在皮下脂肪组织中表达量显著高于其它组织（p<0.0...
【文章页数】：171 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
1.1 脂肪细胞分化研究进展
1.1.1 脂肪组织和脂肪细胞概述
1.1.2 脂肪代谢研究进展
1.1.3 研究脂肪细胞增殖分化的模型
1.2 PAT家族研究进展
1.2.1 PLIN1基因研究进展
1.2.2 PLIN2基因研究进展
1.2.3 TIP47基因研究进展
1.2.4 S3-12基因研究进展
1.2.5 非哺乳动物PAT家族蛋白研究进展
1.3 分子标记辅助育种
1.4 真核生物转录调控及重要转录因子研究进展
1.4.1 C/EBPs家族C/EBPβ
1.4.2 E2F家族E2F1
1.4.3 PLAG基因家族PLAG1
1.4.4 Smads家族Smad3
1.5 多组学高通量测序研究进展
1.5.1 转录组测序研究进展
1.5.2 small RNA测序研究进展
1.5.3 miRNA-mRNA联合分析研究进展
1.6 脂质代谢的重要通路研究进展
1.6.1 AMPK信号通路的组成及调控机制
1.6.2 Wnt信号通路的组成及调控机制
1.6.3 PPAR信号通路的组成及调控机制
1.7 本研究的目的与意义
第二章 PLIN1基因表达模式及其多态位点与秦川肉牛生长性状和肉质性状的关联分析
2.1 前言
2.2 材料与方法
2.2.1 主要仪器与试剂耗材
2.2.2 组织样品及血液采集与冷冻保存
2.2.3 血样DNA的提取、组织样品总RNA的提取和cDNA的合成
2.2.4 实时荧光定量qRT-PCR检测
2.2.5 数据采集
2.2.6 多态位点检测
2.2.7 多态位点分型
2.2.8 数据分析
2.3 结果与分析
2.3.1 组织总RNA电泳检测
2.3.2 PLIN1 基因mRNA表达谱分析
2.3.3 牛PLIN1基因序列分析
2.3.4 PLIN1基因序列同源性分析
2.3.5 PLIN1基因系统进化树
2.3.6 PLIN1基因多态性位点遗传分析
2.3.7 PLIN1 基因SNP位点对秦川肉牛肉质和生长性状的影响
2.3.8 PLIN1基因的连锁不平衡和单倍型关联分析
2.3.9 PLIN1 基因SNP单倍型组合对秦川肉牛肉质和生长性状的影响
2.4 讨论
2.5 小结
第三章 转录因子E2F1、PLAG1、C/EBPβ和SMAD3对PLIN1基因的转录调控作用
3.1 前言
3.2 材料与方法
3.2.1 主要仪器与试剂耗材
3.2.2 启动子双荧光素酶报告载体的构建
3.2.3 细胞培养和报告载体的转染
3.2.4 转录因子的定点突变与基因干扰
3.2.5 凝胶阻滞试验(EMSA)
3.2.6 数据分析
3.3 结果与分析
3.3.1 PCR扩增牛PLIN1 基因启动子区域
3.3.2 重组质粒pGL3-PLIN1 Promoter的鉴定
3.3.4 双荧光素酶报告系统检测牛PLIN1基因启动子逐段缺失片段活性
3.3.5 PLIN1基因核心启动子区域关键转录因子的预测和分析
3.3.6 C/EBPβ,E2F1,PLAG1和SMAD3 结合位点突变对PLIN1 基因启动子活性影响
3.3.7 siC/EBPβ,siE2F1,siPLAG1和siSMAD3 对各转录因子和PLIN1 基因表达量的影响
3.3.8 干扰C/EBPβ,E2F1,PLAG1和SMAD3 表达对PLIN1 基因的启动子活性的影响
3.3.9 C/EBPβ,E2F1,PLAG1和SMAD3 转录因子特异结合PLIN1 基因启动子
3.4 讨论
3.5 小结
第四章 牛PLIN1基因重组过表达腺病毒和干扰腺病毒包装、对牛脂肪细胞增殖、分化和脂类代谢作用
4.1 前言
4.2 材料和方法
4.2.1 主要仪器与试剂耗材
4.2.2 实时荧光定量PCR分析
4.2.3 PLIN1基因过表达腺病毒的包装
4.2.4 PLIN1基因干扰腺病毒的包装
4.2.5 细胞免疫荧光
4.2.6 流式细胞技术分析细胞周期
4.2.7 细胞edu染色
4.2.8 蛋白质免疫印迹分析
4.2.9 油红O染色
4.2.10 甘油三酯(TG)测定
4.2.11 数据分析
4.3 结果与分析
4.3.1 牛PLIN1 基因CDS区克隆与鉴定
4.3.2 牛PLIN1基因过表达腺病毒载体的构建与重组腺病毒包装
4.3.3 牛PLIN1基因干扰腺病毒载体的构建与重组腺病毒包装
4.3.4 PLIN1基因细胞免疫荧光
4.3.5 PLIN1基因过表达和干扰腺病毒的效率检测
4.3.6 干扰和过表达PLIN1基因对牛前体脂肪细胞增殖的影响
4.3.7 过表达和干扰PLIN1基因对牛脂肪细胞分化的影响
4.3.8 过表达和干扰PLIN1 对牛脂肪代谢相关基因的mRNA表达水平的影响
4.3.9 过表达和干扰PLIN1对牛脂肪代谢相关基因的蛋白表达水平的影响
4.4 讨论
4.5 小结
第五章 基于转录组测序分析PLIN1基因对脂类代谢影响及关键基因挖掘
5.1 前言
5.2 材料与方法
5.2.1 主要仪器设备与试剂耗材
5.2.2 牛前体脂肪细胞的分离培养及冷冻保存
5.2.3 牛前体脂肪细胞的复苏、培养及诱导分化
5.2.4 转录组测序(RNA-Seq)研究
5.2.5 实时荧光定量PCR分析
5.2.6 数据分析
5.3 结果与分析
5.3.1 牛前体脂肪细胞总RNA质量检测
5.3.2 转录组测序数据质量评估
5.3.3 转录组测序的可变剪切(AS)事件分析
5.3.4 基因表达水平及RNA-Seq相关性分析
5.3.5 转录组差异表达基因筛选
5.3.6 转录组测序差异表达基因的RT-PCR验证
5.3.7 转录组差异基因GO富集分析
5.3.8 转录组差异基因KEGG富集分析及调控通路
5.3.9 转录组差异基因与脂类代谢相关的KEGG通路分析
5.4 讨论
5.5 小结
第六章 秦川肉牛脂肪细胞small RNA测序及转录组测序关联分析
6.1 前言
6.2 材料与方法
6.2.1 主要仪器设备与试剂耗材
6.2.2 牛前体脂肪细胞的分离培养及冷冻保存
6.2.3 牛前体脂肪细胞的复苏、培养及诱导分化
6.2.4 small RNA测序(small RNA-Seq)研究
6.2.5 small RNA测序数据处理及生物信息学分析
6.2.6 数据分析
6.3 结果与分析
6.3.1 small RNA测序结果分析
6.3.2 参考序列比对结果
6.3.3 miRNA碱基偏好性
6.3.4 已知miRNA、新mi RNA预测、ncRNA和 sRNA分类注释统计的分析
6.3.5 miRNA表达及差异分析
6.3.6 整合分析RNA-seq与 small RNA-seq
6.4 讨论
6.5 小结
第七章 结论
7.1 实验结论
7.2 创新点
7.3 展望
附录
参考文献
致谢
个人简介
【参考文献】：
期刊论文
[1]转录组测序的发展和应用[J]. 王楚彪,卢万鸿,林彦,罗建中. 桉树科技. 2018(04)
[2]脂肪细胞分化的分子机制研究进展[J]. 伍家利,张秀玲,杜润家,黄睿,赵志芳,杨战利. 中国细胞生物学学报. 2017(06)
[3]浅谈我国高档肉牛产业发展思路[J]. 李姣,袁峥嵘,高雪,许尚忠. 北方牧业. 2011(24)
[4]中国肉牛产业现状、热点透析与发展趋势及对策[J]. 昝林森,赵春平,刘扬,刘永峰. 中国农业科技导报. 2009(05)
[5]西农萨能羊两个泌乳阶段差异表达基因SAA3的克隆和序列分析[J]. 武会娟,罗军,张丽娟,韩雪峰,杨宝进,王海滨,单翠燕,张宁,余刚. 畜牧兽医学报. 2007(02)
[6]牛肉酶解物的氨基酸组成分析[J]. 张谦益,张明德,王香林. 肉类研究. 2006(06)
[7]PAT家族蛋白在细胞内脂滴代谢过程中的作用[J]. 刘梅芳,徐国恒. 生理科学进展. 2006(02)
[8]对脂肪滴的新认识(英文)[J]. REN BARTZ,JOHNK ZEHMER. 生物化学与生物物理进展. 2005(05)
[9]Wnt signaling in disease and in development[J]. Roel NUSSE. Cell Research. 2005(01)
本文编号：3660783
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【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
1.1 脂肪细胞分化研究进展
1.1.1 脂肪组织和脂肪细胞概述
1.1.2 脂肪代谢研究进展
1.1.3 研究脂肪细胞增殖分化的模型
1.2 PAT家族研究进展
1.2.1 PLIN1基因研究进展
1.2.2 PLIN2基因研究进展
1.2.3 TIP47基因研究进展
1.2.4 S3-12基因研究进展
1.2.5 非哺乳动物PAT家族蛋白研究进展
1.3 分子标记辅助育种
1.4 真核生物转录调控及重要转录因子研究进展
1.4.1 C/EBPs家族C/EBPβ
1.4.2 E2F家族E2F1
1.4.3 PLAG基因家族PLAG1
1.4.4 Smads家族Smad3
1.5 多组学高通量测序研究进展
1.5.1 转录组测序研究进展
1.5.2 small RNA测序研究进展
1.5.3 miRNA-mRNA联合分析研究进展
1.6 脂质代谢的重要通路研究进展
1.6.1 AMPK信号通路的组成及调控机制
1.6.2 Wnt信号通路的组成及调控机制
1.6.3 PPAR信号通路的组成及调控机制
1.7 本研究的目的与意义
第二章 PLIN1基因表达模式及其多态位点与秦川肉牛生长性状和肉质性状的关联分析
2.1 前言
2.2 材料与方法
2.2.1 主要仪器与试剂耗材
2.2.2 组织样品及血液采集与冷冻保存
2.2.3 血样DNA的提取、组织样品总RNA的提取和cDNA的合成
2.2.4 实时荧光定量qRT-PCR检测
2.2.5 数据采集
2.2.6 多态位点检测
2.2.7 多态位点分型
2.2.8 数据分析
2.3 结果与分析
2.3.1 组织总RNA电泳检测
2.3.2 PLIN1 基因mRNA表达谱分析
2.3.3 牛PLIN1基因序列分析
2.3.4 PLIN1基因序列同源性分析
2.3.5 PLIN1基因系统进化树
2.3.6 PLIN1基因多态性位点遗传分析
2.3.7 PLIN1 基因SNP位点对秦川肉牛肉质和生长性状的影响
2.3.8 PLIN1基因的连锁不平衡和单倍型关联分析
2.3.9 PLIN1 基因SNP单倍型组合对秦川肉牛肉质和生长性状的影响
2.4 讨论
2.5 小结
第三章 转录因子E2F1、PLAG1、C/EBPβ和SMAD3对PLIN1基因的转录调控作用
3.1 前言
3.2 材料与方法
3.2.1 主要仪器与试剂耗材
3.2.2 启动子双荧光素酶报告载体的构建
3.2.3 细胞培养和报告载体的转染
3.2.4 转录因子的定点突变与基因干扰
3.2.5 凝胶阻滞试验(EMSA)
3.2.6 数据分析
3.3 结果与分析
3.3.1 PCR扩增牛PLIN1 基因启动子区域
3.3.2 重组质粒pGL3-PLIN1 Promoter的鉴定
3.3.4 双荧光素酶报告系统检测牛PLIN1基因启动子逐段缺失片段活性
3.3.5 PLIN1基因核心启动子区域关键转录因子的预测和分析
3.3.6 C/EBPβ,E2F1,PLAG1和SMAD3 结合位点突变对PLIN1 基因启动子活性影响
3.3.7 siC/EBPβ,siE2F1,siPLAG1和siSMAD3 对各转录因子和PLIN1 基因表达量的影响
3.3.8 干扰C/EBPβ,E2F1,PLAG1和SMAD3 表达对PLIN1 基因的启动子活性的影响
3.3.9 C/EBPβ,E2F1,PLAG1和SMAD3 转录因子特异结合PLIN1 基因启动子
3.4 讨论
3.5 小结
第四章 牛PLIN1基因重组过表达腺病毒和干扰腺病毒包装、对牛脂肪细胞增殖、分化和脂类代谢作用
4.1 前言
4.2 材料和方法
4.2.1 主要仪器与试剂耗材
4.2.2 实时荧光定量PCR分析
4.2.3 PLIN1基因过表达腺病毒的包装
4.2.4 PLIN1基因干扰腺病毒的包装
4.2.5 细胞免疫荧光
4.2.6 流式细胞技术分析细胞周期
4.2.7 细胞edu染色
4.2.8 蛋白质免疫印迹分析
4.2.9 油红O染色
4.2.10 甘油三酯(TG)测定
4.2.11 数据分析
4.3 结果与分析
4.3.1 牛PLIN1 基因CDS区克隆与鉴定
4.3.2 牛PLIN1基因过表达腺病毒载体的构建与重组腺病毒包装
4.3.3 牛PLIN1基因干扰腺病毒载体的构建与重组腺病毒包装
4.3.4 PLIN1基因细胞免疫荧光
4.3.5 PLIN1基因过表达和干扰腺病毒的效率检测
4.3.6 干扰和过表达PLIN1基因对牛前体脂肪细胞增殖的影响
4.3.7 过表达和干扰PLIN1基因对牛脂肪细胞分化的影响
4.3.8 过表达和干扰PLIN1 对牛脂肪代谢相关基因的mRNA表达水平的影响
4.3.9 过表达和干扰PLIN1对牛脂肪代谢相关基因的蛋白表达水平的影响
4.4 讨论
4.5 小结
第五章 基于转录组测序分析PLIN1基因对脂类代谢影响及关键基因挖掘
5.1 前言
5.2 材料与方法
5.2.1 主要仪器设备与试剂耗材
5.2.2 牛前体脂肪细胞的分离培养及冷冻保存
5.2.3 牛前体脂肪细胞的复苏、培养及诱导分化
5.2.4 转录组测序(RNA-Seq)研究
5.2.5 实时荧光定量PCR分析
5.2.6 数据分析
5.3 结果与分析
5.3.1 牛前体脂肪细胞总RNA质量检测
5.3.2 转录组测序数据质量评估
5.3.3 转录组测序的可变剪切(AS)事件分析
5.3.4 基因表达水平及RNA-Seq相关性分析
5.3.5 转录组差异表达基因筛选
5.3.6 转录组测序差异表达基因的RT-PCR验证
5.3.7 转录组差异基因GO富集分析
5.3.8 转录组差异基因KEGG富集分析及调控通路
5.3.9 转录组差异基因与脂类代谢相关的KEGG通路分析
5.4 讨论
5.5 小结
第六章 秦川肉牛脂肪细胞small RNA测序及转录组测序关联分析
6.1 前言
6.2 材料与方法
6.2.1 主要仪器设备与试剂耗材
6.2.2 牛前体脂肪细胞的分离培养及冷冻保存
6.2.3 牛前体脂肪细胞的复苏、培养及诱导分化
6.2.4 small RNA测序(small RNA-Seq)研究
6.2.5 small RNA测序数据处理及生物信息学分析
6.2.6 数据分析
6.3 结果与分析
6.3.1 small RNA测序结果分析
6.3.2 参考序列比对结果
6.3.3 miRNA碱基偏好性
6.3.4 已知miRNA、新mi RNA预测、ncRNA和 sRNA分类注释统计的分析
6.3.5 miRNA表达及差异分析
6.3.6 整合分析RNA-seq与 small RNA-seq
6.4 讨论
6.5 小结
第七章 结论
7.1 实验结论
7.2 创新点
7.3 展望
附录
参考文献
致谢
个人简介
【参考文献】：
期刊论文
[1]转录组测序的发展和应用[J]. 王楚彪,卢万鸿,林彦,罗建中. 桉树科技. 2018(04)
[2]脂肪细胞分化的分子机制研究进展[J]. 伍家利,张秀玲,杜润家,黄睿,赵志芳,杨战利. 中国细胞生物学学报. 2017(06)
[3]浅谈我国高档肉牛产业发展思路[J]. 李姣,袁峥嵘,高雪,许尚忠. 北方牧业. 2011(24)
[4]中国肉牛产业现状、热点透析与发展趋势及对策[J]. 昝林森,赵春平,刘扬,刘永峰. 中国农业科技导报. 2009(05)
[5]西农萨能羊两个泌乳阶段差异表达基因SAA3的克隆和序列分析[J]. 武会娟,罗军,张丽娟,韩雪峰,杨宝进,王海滨,单翠燕,张宁,余刚. 畜牧兽医学报. 2007(02)
[6]牛肉酶解物的氨基酸组成分析[J]. 张谦益,张明德,王香林. 肉类研究. 2006(06)
[7]PAT家族蛋白在细胞内脂滴代谢过程中的作用[J]. 刘梅芳,徐国恒. 生理科学进展. 2006(02)
[8]对脂肪滴的新认识(英文)[J]. REN BARTZ,JOHNK ZEHMER. 生物化学与生物物理进展. 2005(05)
[9]Wnt signaling in disease and in development[J]. Roel NUSSE. Cell Research. 2005(01)
本文编号：3660783
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