刺参肠道再生的DNA甲基化调控解析及再生候选基因的功能分析

发布时间：2022-08-11 17:02

　　再生作为Science公布的125个最具科学挑战的科学问题中的第7个问题,一直是最受关注的科学热点。目前再生研究主要集中在果蝇、涡虫、蝾螈等模式动物与人类器官再生研究。刺参作为棘皮动物,为无脊索动物中分类地位最高等的类群,具有超强的再生能力,在应答刺激会排出内脏,并很快再生出一套完整的内脏器官,正逐渐成为研究再生的新模型。DNA甲基化是最早发现的修饰之一,能引起染色质结构、DNA构象与稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变,从而控制基因表达,其控制细胞重编程与干细胞分化,对器官再生起到重要的调控作用。由于研究手段与基础数据缺乏等原因,无脊椎动物中特别是棘皮动物中的DNA甲基化对动物特殊生理行为的调控研究严重滞后,本人所在团队的刺参基因组的解析为DNA甲基化修饰对刺参肠道再生的调控研究带来了良好的契机。综上所述,研究DNA甲基化修饰和候选再生基因在刺参肠道再生中的作用不仅为海参肠道再生的分子机制研究提供参考,而且可以为人类再生医学研究提供新思路,同时可以为DNA甲基化再生药物研制和再生途径研究提供理论指导。本研究利用 WGBS（Whole Genome Bisulfite Sequen... 

【文章页数】：182 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
第一章 绪论
    1.1 DNA甲基化研究进展
        1.1.1 DNA甲基化
        1.1.2 DNA甲基化调控转录机制
    1.2 DNA甲基化调控酶研究进展
        1.2.1 DNA甲基化酶
        1.2.2 DNA去甲基化酶
    1.3 再生相关信号通路和基因研究概述
        1.3.1 Src/PI3K/Akt信号通路
        1.3.2 MAPK/ERK信号通路
        1.3.3 JAK/STAT信号通路
        1.3.4 Wnt信号通路
        1.3.5 再生相关转录因子
        1.3.6 其他再生相关基因
    1.4 棘皮动物再生研究进展
    1.5 海参再生研究进展
    1.6 本研究的目的意义与研究思路
        1.6.1 目的与意义
        1.6.2 科学问题
        1.6.3 研究内容与技术路线
        1.6.4 预期成果
    1.7 本章小结
第二章 DNA甲基化调控酶在刺参肠道再生中的调控机制研究
    2.1 前言
    2.2 材料与方法
        2.2.1 样品采集
        2.2.2 RNA提取和反转录
        2.2.3 刺参DNA甲基化调控酶Dnmt3b、TDG和Tet2过表达载体构建
        2.2.4 RNAi片段siRNA制备
        2.2.5 刺参Dnmt3b、TDG和Tet2基因体内过表达和RNAi
        2.2.6 刺参Dnmt3b、TDG和Tet2基因体外过表达
        2.2.7 CCK8细胞增殖检测
        2.2.8 刺参Dnmt3b、TDG和Tet2基因序列和系统进化树分析
        2.2.9 数据分析
    2.3 实验结果
        2.3.1 DNA甲基化调控酶和甲基结合蛋白在刺参肠道再生过程中的表达特征
        2.3.2 刺参Dnmt3b、TDG和Tet2基因过表达载体构建
        2.3.3 刺参Dnmt3b、TDG和Tet2基因序列和系统进化树分析
        2.3.4 刺参Dnmt3b、TDG和Tet2基因体外过表达
        2.3.5 体外过表达Dnmt3b、TDG和Tet2对细胞增殖相关基因表达的影响
        2.3.6 体外过表达刺参Dnmt3b、TDG和Tet2基因对HCT116细胞增殖的影响
        2.3.7 体内过表达Dnmt3b、Tet2和TDG对刺参细胞增殖相关基因表达的影响
        2.3.8 体内干扰刺参Dnmt3b、Tet2和TDG基因对刺参增殖相关基因表达的影响
    2.4 讨论
        2.4.1 DNA甲基化和DNA去甲基化同时参与刺参肠道再生初期的基因调控
        2.4.2 刺参DNA甲基化调控酶基因Dnmt3b、Tet2和TDG序列和进化树分析
        2.4.3 刺参DNA甲基化调控酶基因Dnmt3b、Tet2和TDG参与调控增殖相关基因的表达
    2.5 本章小结
第三章 DNA甲基化对刺参肠道再生的影响
    3.1 前言
    3.2 材料与方法
        3.2.1 样品采集
        3.2.2 刺参肠道原代细胞培养
        3.2.3 刺参肠道原代细胞存活率检测
        3.2.4 CCK8检测刺参肠道原代细胞增殖
        3.2.5 药物处理后基因检测实验
        3.2.6 刺参肠道原代细胞总RNA提取和RT-qPCR
        3.2.7 5-氮杂胞苷体内刺激实验
    3.3 实验结果
        3.3.1 刺参肠道原代细胞培养
        3.3.2 抑制DNA甲基化对吐肠后刺参体内肠道再生的影响
        3.3.3 抑制DNA甲基化对吐肠后刺参体内肠道组织基因表达的影响
    3.4 讨论
        3.4.1 DNA甲基化在刺参肠道再生中的关键作用
        3.4.2 抑制DNA甲基化对刺参肠道增殖和DNA甲基化相关基因表达的影响
    3.5 本章小结
第四章 刺参肠道再生DNA甲基化图谱构建
    4.1 前言
    4.2 材料与方法
        4.2.1 样品采集
        4.2.2 DNA提取
        4.2.3 全基因组DNA甲基化建库测序流程
        4.2.4 序列比对与DNA甲基化水平检测
        4.2.5 差异DNA甲基化区域与DNA甲基化水平差异检测
        4.2.6 GO注释与KEGG富集分析
        4.2.7 DNA甲基化基因DNA序列获取
        4.2.8 PCR产物纯化测序
        4.2.9 DNA克隆
        4.2.10 硫化处理
        4.2.11 BSP-PCR扩增
        4.2.12 BSP-PCR产物纯化和目的片段克隆测序
    4.3 实验结果
        4.3.1 DNA质量
        4.3.2 全基因组DNA甲基化数据统计分析
        4.3.3 全基因组和不同转录元件DNA甲基化水平分析
        4.3.4 DMRs相关基因数量统计
        4.3.5 DMRs相关基因的GO和KEGG分析
        4.3.6 DMRs相关基因BSP验证
    4.4 讨论
        4.4.1 刺参肠道再生不同时间的DNA甲基化调控机制不同
        4.4.2 神经、免疫和代谢相关通路参与刺参肠道再生受DNA甲基化调控
        4.4.3 蛋白修饰、转录因子和粘附分子类基因参与肠道再生受DNA甲基化调控
    4.5 本章小结
第五章 刺参肠道再生初级阶段转录组表达谱的构建
    5.1 前言
    5.2 材料与方法
        5.2.1 样品采集
        5.2.2 总RNA提取、cDNA文库构建与测序、序列过滤、比对和质量评估
        5.2.3 基因表达定量分析及差异表达基因(DEG)筛选
        5.2.4 GO功能和KEGG富集分析
        5.2.5 DNA甲基化和转录组联合分析
        5.2.6 Real time PCR
    5.3 实验结果
        5.3.1 测序数据统计分析
        5.3.2 RT-qPCR验证
        5.3.3 DEGs筛选和热图聚类分析
        5.3.4 DEGs的GO和KEGG富集分析
    5.4 讨论
    5.5 本章小结
第六章 再生候选基因在刺参肠道再生中的调控机制
    6.1 前言
    6.2 材料与方法
        6.2.1 样品采集和处理
        6.2.2 mRNA和蛋白提取
        6.2.3 RACE克隆
        6.2.4 RT-qPCR
        6.2.5 抗体制备和Western blot
        6.2.6 免疫组织化学和TUNEL细胞凋亡检测
        6.2.7 过表达载体构建
        6.2.8 细胞转染
        6.2.9 细胞增殖检测
        6.2.10 序列聚类分析和数据分析
    6.3 实验结果
        6.3.1 DNA甲基化候选基因在刺参肠道再生过程中的表达特征
        6.3.2 过表达载体构建
        6.3.3 开放阅读框序列克隆和分析
        6.3.4 体外过表达DNA甲基化候选基因对增殖相关基因的影响
        6.3.5 WntA基因序列和表达特征分析
        6.3.6 WntA蛋白表达定位
        6.3.7 刺参肠道再生过程中的增殖与凋亡
        6.3.8 Wnt家族基因以及信号通路关键基因在刺参肠道再生中的表达特征
    6.4 讨论
        6.4.1 DNA甲基化候选基因调控刺参肠道再生机制
        6.4.2 候选基因WntA在刺参肠道再生中的作用
        6.4.3 Wnt信号通路参与刺参肠道再生
    6.5 本章小结
第七章 总结与展望
    7.1 总结
    7.2 创新性
    7.3 存在问题
    7.4 研究展望
参考文献
致谢
作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果



本文编号：3675044