CRISPR/Cas9技术在伪狂犬病毒研究中的应用

发布时间：2023-02-09 07:13

　　近年来,猪伪狂犬病毒(PRV)变异株在我国爆发,根据全基因组序列分析,该变异株属于基因II型PRV。传统的Bartha-K61疫苗不能对变异毒株提供完全保护。对我国养猪业具有很大的潜在威胁。因此,对变异毒株的研究迫在眉睫。PRV基因组较大,GC含量高,难于操作。所以本研究采用CRISPR/Cas9技术对PRV进行多方面研究。本研究首先应用CRISPR-Cas9技术建立了高效编辑PRV基因组的平台,并应用该平台在短时间内构建了 gE/gl/TK三基因缺失毒株。该毒株在小鼠上失去了致病力,并且诱导小鼠机体免疫反应,抵抗PRV强毒株的攻击。短时间内构建疫苗株对PRV的防控,特别是当新型变异毒株爆发的防控极为重要。众所周知,sgRNA的筛选是决定CRISPR/Cas9系统成功与否的关键,应用传统的筛选方法费时费力。本研究成功构建了同时表达EGFP，Luciferase的双报告病毒。Luciferase活性可在感染4小时后检测到。而且该病毒稳定性良好。通过该报告病毒可以快速筛选sgRNA以及抗病毒药物。本研究应用CRISPR/Cas9技术建立了 DNA大片段缺失平台,敲除效率几乎达到100%。最...

【文章页数】：47 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
第一章 综述
    1.1 PRV研究概况
    1.2 基因编辑技术研究进展
        1.2.1 ZFN技术
        1.2.2 TALLEN技术
        1.2.3 CRISPR技术
第二章 研究报告
    2.1 材料与方法
        2.1.1 PRV基因组的提取
    2.2 结果
        2.2.1 PRV基因敲除平台的建立
            2.2.1.1 有效sgRNA的筛选
            2.2.1.2 CRISPR/Cas9介导高效的PRV基因组编辑
            2.2.1.3 CRISPR/Cas9介导PRV基因gI与TK敲除
            2.2.1.4 gE-/gI-/TK-致病性评估
            2.2.1.5 gE-/gI-/TK-免疫保护评估
        2.2.2 高效筛选SgRNA平台的建立
            2.2.2.1 表达EGF与Firefly Luciferase双报告基因重组PRV的构建
            2.2.2.2 应用PRV-Luc-EGFP重组病毒筛选SgRNA
            2.2.2.3 应用PRV-Luc-EGFP重组病毒筛选抗病毒药物
        2.2.3 DNA大片段敲除平台的建立
        2.2.4 CRISPR/Cas9在PRV抗病毒研究中的应用
        2.2.5 CRISPR/Cas9技术筛选PRV变异毒株关键毒力基因
    2.3 讨论
    2.4 结论
参考文献
致谢
作者简历



本文编号：3738452