稻瘟菌菌丝细胞壁蛋白的鉴定和一个剪切因子MoSrp1的功能研究
发布时间：2023-04-21 19:47
细胞壁是真菌细胞最外面的结构,在适应外界环境变化和与寄主互作等过程中起着重要的作用。细胞壁蛋白作为细胞壁的组成部分,其中有些蛋白作为真菌的致病因子在侵染寄主植物过程中发挥重要作用。稻瘟菌细胞壁蛋白不仅有助于揭示稻瘟菌的致病机理,也可为绿色杀菌剂的设计提供候选靶标。尽管有关稻瘟菌致病相关基因的研究报道很多,然而,关于稻瘟菌细胞壁蛋白系统研究的报道几乎没有。为此,在本研究中,作者对稻瘟菌菌丝细胞壁蛋白进行了分离鉴定,并对其中部分蛋白的编码基因的功能进行了分析。在本研究中,作者首先利用梯度离心的方法分离了野生型P131和敲除体Δalg3的菌丝细胞壁,然后依次用CaCl2和lysing enzymes对细胞壁蛋白进行了抽提,最后通过LC-MS/MS鉴定以及胞外定位、信号肽等条件的筛选,得到P131和Δalg3的细胞壁蛋白分别为109和107个。其中有78个蛋白在P131和Δalg3中重叠出现,因此一共138个蛋白被鉴定到。作者对138个蛋白的生物学功能进行了预测分析,发现这些细胞壁蛋白主要参与碳水化合物代谢、氧化还原、蛋白水解以及对逆境反应等14个生物学过程。在上述78个重叠鉴定的蛋白中,包括...
【文章页数】：114 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表
第一章 绪论
1.1 稻瘟病的危害
1.2 稻瘟菌的生物学特性
1.3 细胞壁蛋白在真核生物中的研究现状
1.3.1 植物细胞壁蛋白的研究现状
1.3.2 真菌细胞壁蛋白的研究现状
1.3.3 Alg3在真菌N-糖基化中的作用的研究现状
1.4 RNA结合蛋白在真核生物转录后调控中的研究现状
1.5 本研究的立论依据和研究意义
第二章 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 稻瘟菌菌株
2.1.2 工具菌株
2.1.3 植物材料
2.1.4 常用载体
2.2 工具酶、试剂盒及各类化学试剂
2.2.1 DNA操作相关
2.2.2 RNA操作相关
2.2.3 蛋白质操作相关
2.2.4 酵母双杂交、酵母筛库相关
2.2.5 常用抗生素及药品
2.3 常用培养基和试剂的配方
2.3.1 常用培养基的配方
2.3.2 常用试剂的配方
2.4 实验仪器和耗材
2.5 实验方法
2.5.1 同源序列分析
2.5.2 蛋白的进化树分析
2.5.3 蛋白的生物信息学分析
2.5.4 常规分子生物学操作
2.5.5 稻瘟菌研究实验技术
第三章 稻瘟菌菌丝细胞壁蛋白的鉴定
3.1 稻瘟菌菌丝细胞壁蛋白的分离、鉴定和分析
3.1.1 细胞壁蛋白的分离
3.1.2 质谱结果分析及蛋白鉴定
3.1.3 细胞壁蛋白的生物信息学分析
3.2 Gel家族蛋白是一类细胞壁蛋白
3.2.1 Gel蛋白家族中Gel1-4存在于细胞壁蛋白组中
3.2.2 Gel蛋白家族定位在细胞壁
3.2.3 Gel家族蛋白参与了细胞壁完整性
3.2.4 单个的Gel家族蛋白不影响稻瘟菌的致病力
3.3 细胞壁蛋白Cwg1、Echt1为P131和Δalg3的细胞壁蛋白组共有
3.3.1 Cwg1、Echt1是P131和Δalg3的菌丝细胞壁蛋白组中共有的蛋白
3.3.2 Cwg1、Echt1在P131和Δalg3中均定位于细胞壁
3.3.3 CWG1和ECHT1的敲除
3.3.4 CWG1和ECHT1参与了细胞壁完整性
3.3.5 CWG1和ECHT1均影响稻瘟菌的营养生长
3.3.6 Cwg1影响稻瘟菌的致病力,而Echt1对致病力没影响
3.3.7 Cwg1通过控制稻瘟菌侵染菌丝扩展影响致病力
3.3.8 Cwg1家族和Echt1家族蛋白的相对表达量和进化树分析
3.4 Alg3介导的细胞壁蛋白Lvh1参与了稻瘟菌的产孢
3.4.1 Lvh1是P131的菌丝细胞壁蛋白组特有的蛋白
3.4.2 VLH1的敲除
3.4.3 A1g3部分影响Lvh1的定位
3.4.4 Lvh1与细胞壁完整性有关
3.4.5 LVH1影响稻瘟菌的产孢
3.4.6 LVH1同源基因的相对表达量和进化树分析
3.5 讨论
第四章 稻瘟菌中一个剪切因子MoSrpl的功能研究
4.1 基因MoSRP1的克隆
4.2 MoSRP1是稻瘟菌正常无性发育所必需的
4.2.1 MoSRP1控制稻瘟菌菌丝的细胞周期
4.2.2 MoSRP1参与稻瘟菌分生孢子产生和形态建成
4.3 MoSRP1控制稻瘟菌的侵染菌丝扩展
4.4 MoSrp1是一个核蛋白
4.5 MoSrp1与三个核蛋白在酵母体内互作
4.6 MoSrp1与MoRnps1在稻瘟菌体内互作
4.7 RRM区域对MoSrp1发挥功能是必需的
4.7.1 RRM区域主要决定了敲除体srp1ko1的菌落生长缺陷
4.7.2 RRM区域主要决定了敲除体srp1ko1的产孢
4.7.3 RRM区域主要决定了敲除体srp1ko1致病力的缺陷
4.7.4 MoSrp1通过RRM区域与MoRnps1、MoThoc1和MoGrp1互作
4.8 三个保守丝氨酸位点的磷酸化对MoSrp1的功能有一定影响
4.9 MoSrp1具有结合RNA基序“GUAG”的能力
4.9.1 RIP-seq揭示MoSrp1结合的候选靶标RNA基序为“GUAG”
4.9.2 MoSrp1在大肠杆菌中的表达与纯化
4.9.3 RNA-EMSA证明MoSrp1与“GUAG”结合
4.10 敲除体srp1ko1的RNA-seq结果分析
4.11 MoSrp1影响MoATF1中具有“GTAG”的内含子的剪切效率
4.12 讨论
第五章 全文总结
参考文献
致谢
附录
附录一 本研究鉴定到的细胞壁蛋白列表
附录二 文中研究的蛋白的LC-MS/MS数据
附录三 MoSrp1的Pull-down蛋白列表(Srp1-Flag两个转化子共有的)
附录四 MoSrp1的酵母筛库蛋白列表
附录五 srp1ko1转录组中下调2倍以上且含有“GTAG”的核基因列表
附录六 MoSrp1影响内含子保留的且定位在细胞核的已报道基因列表
附录七 文中涉及的引物列表
作者简历
本文编号：3796138
【文章页数】：114 页
【学位级别】：博士
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摘要
Abstract
缩略语表
第一章 绪论
1.1 稻瘟病的危害
1.2 稻瘟菌的生物学特性
1.3 细胞壁蛋白在真核生物中的研究现状
1.3.1 植物细胞壁蛋白的研究现状
1.3.2 真菌细胞壁蛋白的研究现状
1.3.3 Alg3在真菌N-糖基化中的作用的研究现状
1.4 RNA结合蛋白在真核生物转录后调控中的研究现状
1.5 本研究的立论依据和研究意义
第二章 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 稻瘟菌菌株
2.1.2 工具菌株
2.1.3 植物材料
2.1.4 常用载体
2.2 工具酶、试剂盒及各类化学试剂
2.2.1 DNA操作相关
2.2.2 RNA操作相关
2.2.3 蛋白质操作相关
2.2.4 酵母双杂交、酵母筛库相关
2.2.5 常用抗生素及药品
2.3 常用培养基和试剂的配方
2.3.1 常用培养基的配方
2.3.2 常用试剂的配方
2.4 实验仪器和耗材
2.5 实验方法
2.5.1 同源序列分析
2.5.2 蛋白的进化树分析
2.5.3 蛋白的生物信息学分析
2.5.4 常规分子生物学操作
2.5.5 稻瘟菌研究实验技术
第三章 稻瘟菌菌丝细胞壁蛋白的鉴定
3.1 稻瘟菌菌丝细胞壁蛋白的分离、鉴定和分析
3.1.1 细胞壁蛋白的分离
3.1.2 质谱结果分析及蛋白鉴定
3.1.3 细胞壁蛋白的生物信息学分析
3.2 Gel家族蛋白是一类细胞壁蛋白
3.2.1 Gel蛋白家族中Gel1-4存在于细胞壁蛋白组中
3.2.2 Gel蛋白家族定位在细胞壁
3.2.3 Gel家族蛋白参与了细胞壁完整性
3.2.4 单个的Gel家族蛋白不影响稻瘟菌的致病力
3.3 细胞壁蛋白Cwg1、Echt1为P131和Δalg3的细胞壁蛋白组共有
3.3.1 Cwg1、Echt1是P131和Δalg3的菌丝细胞壁蛋白组中共有的蛋白
3.3.2 Cwg1、Echt1在P131和Δalg3中均定位于细胞壁
3.3.3 CWG1和ECHT1的敲除
3.3.4 CWG1和ECHT1参与了细胞壁完整性
3.3.5 CWG1和ECHT1均影响稻瘟菌的营养生长
3.3.6 Cwg1影响稻瘟菌的致病力,而Echt1对致病力没影响
3.3.7 Cwg1通过控制稻瘟菌侵染菌丝扩展影响致病力
3.3.8 Cwg1家族和Echt1家族蛋白的相对表达量和进化树分析
3.4 Alg3介导的细胞壁蛋白Lvh1参与了稻瘟菌的产孢
3.4.1 Lvh1是P131的菌丝细胞壁蛋白组特有的蛋白
3.4.2 VLH1的敲除
3.4.3 A1g3部分影响Lvh1的定位
3.4.4 Lvh1与细胞壁完整性有关
3.4.5 LVH1影响稻瘟菌的产孢
3.4.6 LVH1同源基因的相对表达量和进化树分析
3.5 讨论
第四章 稻瘟菌中一个剪切因子MoSrpl的功能研究
4.1 基因MoSRP1的克隆
4.2 MoSRP1是稻瘟菌正常无性发育所必需的
4.2.1 MoSRP1控制稻瘟菌菌丝的细胞周期
4.2.2 MoSRP1参与稻瘟菌分生孢子产生和形态建成
4.3 MoSRP1控制稻瘟菌的侵染菌丝扩展
4.4 MoSrp1是一个核蛋白
4.5 MoSrp1与三个核蛋白在酵母体内互作
4.6 MoSrp1与MoRnps1在稻瘟菌体内互作
4.7 RRM区域对MoSrp1发挥功能是必需的
4.7.1 RRM区域主要决定了敲除体srp1ko1的菌落生长缺陷
4.7.2 RRM区域主要决定了敲除体srp1ko1的产孢
4.7.3 RRM区域主要决定了敲除体srp1ko1致病力的缺陷
4.7.4 MoSrp1通过RRM区域与MoRnps1、MoThoc1和MoGrp1互作
4.8 三个保守丝氨酸位点的磷酸化对MoSrp1的功能有一定影响
4.9 MoSrp1具有结合RNA基序“GUAG”的能力
4.9.1 RIP-seq揭示MoSrp1结合的候选靶标RNA基序为“GUAG”
4.9.2 MoSrp1在大肠杆菌中的表达与纯化
4.9.3 RNA-EMSA证明MoSrp1与“GUAG”结合
4.10 敲除体srp1ko1的RNA-seq结果分析
4.11 MoSrp1影响MoATF1中具有“GTAG”的内含子的剪切效率
4.12 讨论
第五章 全文总结
参考文献
致谢
附录
附录一 本研究鉴定到的细胞壁蛋白列表
附录二 文中研究的蛋白的LC-MS/MS数据
附录三 MoSrp1的Pull-down蛋白列表(Srp1-Flag两个转化子共有的)
附录四 MoSrp1的酵母筛库蛋白列表
附录五 srp1ko1转录组中下调2倍以上且含有“GTAG”的核基因列表
附录六 MoSrp1影响内含子保留的且定位在细胞核的已报道基因列表
附录七 文中涉及的引物列表
作者简历
本文编号：3796138
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