基于RNA-Seq的兰州百合鳞茎淀粉-蔗糖代谢关键酶SuSy和INV基因的挖掘

发布时间：2017-05-29 00:08

  本文关键词：基于RNA-Seq的兰州百合鳞茎淀粉-蔗糖代谢关键酶SuSy和INV基因的挖掘，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：淀粉是百合鳞茎中碳水化合物的重要贮藏形式,而蔗糖是百合鳞茎中糖分运转的主要形式,淀粉-蔗糖代谢在百合生长发育中起重要作用。蔗糖在蔗糖合成酶(Sucrose Synthase, SuSy)和转化酶(Invertase, INV)调控下参与淀粉的合成,而SuSy和INV基因家族都有多个成员组成,而在不同植物中不同成员功能也不尽相同。因此,明确百合SuSy和INV的生理作用、基因功能成为进一步弄清淀粉合成途径及小鳞茎形成与发育机制的首要任务。为阐明百合SuSy和INV基因调控蔗糖进入淀粉合成途径的机制,本研究在转录组水平筛选在百合鳞茎发育过程中差异表达的SuSy和INV基因,并构建其过表达与RNAi载体。本研究的主要研究结果如下：1.采用改良CTAB、SDS法与TRIzol法,提取百合鳞茎中的总RNA。结果表明,SDS法和CTAB法经改良后,均可从外、中、内层鳞片中提取出电泳条带清晰、28S条带亮度约为18S条带亮度2倍、A260/A280在1.8-2.2之间的总RNA; TRIzol法虽然快捷易操作,但不能有效去除多糖污染。经RT-PCR检验,三种方法提取的RNA反转录后的cDNA,TRIzol法扩增后无条带出现,SDS法扩增得到的条带亮度较弱,而改良CTAB法能够扩增得到亮度很高的目的条带,并且CTAB法经验证可用于鳞茎不同部位(外层鳞片、中层鳞片、内层鳞片、顶芽和鳞茎盘)RNA的提取。2.对百合小鳞茎形成与发育过程进行转录组测序,选取鳞片扦插0 d、15d(小鳞茎出现)和35 d(小鳞茎基本形成)三个阶段,最终得到52901个unigene,平均长度为630 nt,N50为926 nt。对获得的unigene进行BLAST比对,共有37 385条unigene成功注释,占转录组数据的70.67%。通过COG比对,有11 150条unigene成功比对,根据功能分为24类,涉及了大多数的生命活动,其中一般功能预测(general function prediction only) unigene数目最多。利用BLAST2GO,最终有26 333条unigene得到注释,在所有功能分类中,有多个参与碳水化合物代谢。SSR分析得到1 596个SSR序列,主要为单碱基重复。3.选用百合小鳞茎形成与发育三个阶段转录组中表达比较稳定的11个内参基因,其中包括9个传统内参基因(α-TUB、β-TUB、ACT、elF、GAPDH、UBQ、UBC和60S)和3个新型候选基因(AP4、FP和RH2),另外选择在百合qRT-PCR中应用较多的18S基因,使用geNorm软件、Normfinder软件、Bestkeeper软件和ACt法评价其在不同试验条件下的稳定性,最终通过RefFinder软件进行综合评价。结果表明,在不同组织器官中,ACT、GAPDH和UBQ三个内参基因的稳定性最高；在不同发育过程中,叶片中表达稳定的内参基因是ACT、AP4和RH2,而鳞片中表达最稳定基因的是GAPDH、ACT和FP；低温、高温及盐胁迫等逆境处理后,FP、UBC和UBQ在叶片中的表达最稳定,ACT, FP和AP4在鳞片中表达最稳定,而AP4、UBC和RH2在根中的表达要比其他基因稳定；在所有样品中,表达最稳定的基因是FP、AP4和GAPDH。4.利用数字化表达谱测序,在小鳞茎形成与发育转录组测序基础上,通过生物学分析筛选不同样品中的差异表达基因,对其进行代谢富集分析,并对差异表达的淀粉-蔗糖代谢关键酶的基因表达模式进行分析,探讨淀粉-蔗糖代谢在小鳞茎形成与发育中的作用。结果发现,小鳞茎出现阶段(15 d)代谢比较活跃,差异表达基因数目最多。对差异表达基因的GO分析表明,细胞组分功能中以细胞(cell)为主,分子功能中大多数基因富集到催化活性(binding activity),在生物学过程中代谢过程(metabolic processes)参与的基因最多。代谢通路分析表明,淀粉-蔗糖代谢占主要位置。碳水化合物含量测定结果表明,母鳞片中淀粉含量呈下降趋势,而小鳞茎中淀粉含量呈上升趋势；母鳞片中蔗糖含量在小鳞茎出现与形成阶段及42 d后急剧下降,而小鳞茎中蔗糖含量在小鳞茎出现与形成阶段增加,此后变化幅度较小。小鳞茎出现与形态建成阶段蔗糖降解方向相关酶(SuSy和INV)在母鳞片中的基因表达量要高于小鳞茎,而小鳞茎膨大阶段则主要在小鳞茎中表达；蔗糖合成方向相关酶(SPS)在母鳞片中的基因表达量呈下降趋势,而在小鳞茎中的表达量在形态建成阶段较高。淀粉合成相关酶在小鳞茎中的表达丰度要高于母鳞片中的表达丰度,且以支链淀粉合成相关酶为主；而淀粉分解相关酶的基因表达量在母鳞片中较高。5.构建在百合小鳞茎形成与发育过程中差异表达的SuSy家族基因SuSy1、SuSy2、 SuSy3和INV家族基因SAI的过表达载体与RNAi载体。最终利用Gateway技术,成功构建得到SuSy3的过表达载体pMDC-SuSy3和RNAi载体pB7WIWG-SuSy3；利用Gibson Assembly技术成功构建得到SuSy1、SuSy2和SAI的过表达载体pCAMBIA-S1、 pCAMBIA-S2和pCAMBIA-SAI;利用双酶切法成功构建得到SuSy1、SuSy2和SAI的RNAi载体pTCK-S1、pTCK-S2和pTCK-SAI,为通过转基因技术探讨SuSy1、SuSy2、 SuSy3和SAI的功能奠定基础。总之,本研究在RNA-seq基础上挖掘百合小鳞茎形成与发育过程中差异表达的淀粉-蔗糖关键酶SuSy和IN,探讨其在小鳞茎发育不同阶段的表达模式,并构建其过表达与RNAi载体,为明确SuSy和INV的生理作用及基因功能奠定基础,从而为弄清百合鳞茎淀粉合成途径、生产优质种球提供依据。
【关键词】：兰州百合 小鳞茎发育 转录组 淀粉-蔗糖代谢 载体构建
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S682.29
【目录】：

• 摘要10-12
• Abstract12-14
• 1. 前言14-34
• 1.1 淀粉-蔗糖代谢关键酶研究进展14-21
• 1.1.1 蔗糖的作用及其代谢关键酶14-16
• 1.1.2 SuSy研究进展16-19
• 1.1.3 INV研究进展19-21
• 1.2 百合总RNA的提取方法及影响因素21-24
• 1.2.1 RNA提取方法概述22-23
• 1.2.2 百合RNA提取23-24
• 1.3 RNA-seq技术24-30
• 1.3.1 转录组测序技术概述24-26
• 1.3.2 植物转录组测序研究进展26-30
• 1.4 内参基因的筛选30-32
• 1.4.1 内参基因概述30-31
• 1.4.2 内参基因筛选研究动态31-32
• 1.5 研究思路与技术路线32-34
• 1.5.1 研究思路32-33
• 1.5.2 技术路线33-34
• 2 百合鳞茎总RNA高效提取体系的建立34-45
• 2.1 材料与方法34-37
• 2.1.1 植物材料34
• 2.1.2 主要试剂34-35
• 2.1.3 外源RNase的去除35
• 2.1.4 试验方法35-37
• 2.2 结果与分析37-42
• 2.2.1 改良SDS法提取RNA的凝胶电泳分析37-41
• 2.2.2 TRIzol法提取RNA效果41
• 2.2.3 RT-PCR扩增效果41-42
• 2.2.4 CTAB法提取百合鳞茎不同部位RNA效果42
• 2.3 讨论42-45
• 2.3.1 防止RNase污染、RNA降解的措施42-43
• 2.3.2 提取方法的选择43-45
• 3 基于Illumina平台的百合小鳞茎形成与发育转录组学研究45-55
• 3.1 材料与方法45-46
• 3.1.1 材料45
• 3.1.2 试剂45
• 3.1.3 RNA提取、cDNA文库构建、测序及组装45-46
• 3.1.4 基因功能注释46
• 3.1.5 SSR分析46
• 3.1.6 unigene预测编码蛋白区CDS46
• 3.2 结果与分析46-53
• 3.2.1 小鳞茎形成与发育过程分析46-47
• 3.2.2 测序和组装结果47
• 3.2.3 基因注释和功能分类47-52
• 3.2.4 SSR分析结果52
• 3.2.5 编码区预测和蛋白序列翻译52-53
• 3.3 讨论53-55
• 4 百合qRT-PCR内参基因的筛选55-67
• 4.1 材料与方法55-57
• 4.1.1 材料55
• 4.1.2 试剂55-56
• 4.1.3 RNA提取及cDNA合成56
• 4.1.4 候选内参基因引物设计56
• 4.1.5 内参基因的qRT-PCR分析56-57
• 4.1.6 表达稳定性分析57
• 4.2 结果与分析57-65
• 4.2.1 引物特异性分析57-58
• 4.2.2 引物的扩增效率分析58-59
• 4.2.3 内参基因的表达稳定性分析59-65
• 4.3 讨论65-67
• 5 百合小鳞茎发育不同阶段表达谱构建及特征分析67-81
• 5.1 材料与方法67-69
• 5.1.1 材料67
• 5.1.2 试剂67
• 5.1.3 RNA提取、cDNA文库构建、测序及组装67-68
• 5.1.4 基因差异表达分析68
• 5.1.5 差异表达基因功能分析68
• 5.1.6 淀粉和蔗糖含量测定68
• 5.1.7 淀粉-蔗糖代谢关键酶基因的qRT-PCR分析68-69
• 5.2 结果与分析69-78
• 5.2.1 差异表达基因的分布69-70
• 5.2.2 不同样品间的差异表达基因比较70
• 5.2.3 差异表达基因的GO分析70-72
• 5.2.4 差异表达基因的通路分析72-73
• 5.2.5 淀粉-蔗糖代谢相关基因功能富集分析73-75
• 5.2.6 淀粉和蔗糖含量测定结果75
• 5.2.7 淀粉-蔗糖代谢相关酶的qRT-PCR检测75-78
• 5.3 讨论78-81
• 5.3.1 百合小鳞茎发育不同阶段表达谱78-79
• 5.3.2 淀粉-蔗糖代谢作用79
• 5.3.3 小鳞茎形成与发育过程中的基因表达79-81
• 6 SuSy与INV基因的载体构建81-98
• 6.1 材料与方法81-92
• 6.1.1 主要试剂81
• 6.1.2 试验所用的菌株与载体81-82
• 6.1.3 SuSy3过表达载体的构建82-84
• 6.1.4 SuSy3 RNAi载体的构建84-86
• 6.1.5 S1、S2和SAI过表达载体的构建86-88
• 6.1.6 S1、S2及SAIRNAi载体的构建88-92
• 6.2 结果与分析92-97
• 6.2.1 SuSy3过表达载体的构建92-93
• 6.2.2 SuSy3 RNAi载体的构建93-94
• 6.2.3 S1、S2、SAI过表达载体的构建94-96
• 6.2.4 S1、S2及SAIRNAi载体的构建96-97
• 6.3 讨论97-98
• 全文总结98-101
• 主要创新点101-102
• 参考文献102-128
• 附录128-129
• 致谢129-130
• 攻读学位期间发表的学术论文130-131
• 附件131

【参考文献】

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本文编号：403742