甘露糖受体介导的多糖重组抗原铜绿假单胞菌疫苗的研制及其免疫分子机制

发布时间：2017-06-05 16:42

  本文关键词：甘露糖受体介导的多糖重组抗原铜绿假单胞菌疫苗的研制及其免疫分子机制，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：随着免疫学研究的不断深入和基因工程技术的迅速发展，为避免传统灭活苗接种剂量较大，产生免疫力较慢，弱毒苗毒力返强的缺点，针对不同疾病已开展了各种新型基因工程疫苗的研制。但这些疫苗普遍存在分子小、免疫原性弱、难以诱导机体产生有效免疫应答等不足，从而需要某种载体或佐剂来弥补这种不足。传统载体或佐剂又存在许多缺陷，如引起局部炎症反应、致癌、不易在体内降解等，所以需要研发新型载体或佐剂来克服上述缺点[183]。 壳聚糖，是来自甲壳素的天然高分子多糖，在体内其能被溶菌酶生物降解。具有黏膜粘附的特点，是一种黏膜吸收增强剂，己被用作黏膜给药的载体。聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)由乳酸和羟基乙酸随机聚合而成，是一种可降解的功能高分子有机化合物[186]，具有良好的生物相容性、成囊、成膜和无毒性。在美国PLGA已通过FDA认证，被正式作为药用辅料收录进美国药典[187]。甘露糖是目前唯一用于在临床上的糖质营养素，其可直接被利用合成糖蛋白，参与免疫细胞上甘露糖受体介导的内吞等免疫调节作用，进一步激活T淋巴细胞，提高MHC-I和MHC-II分子的抗原递呈。因此运用壳聚糖、PLGA和甘露糖这三种可生物降解材料作为新型的疫苗载体或佐剂具有巨大的潜力。 本研究采用分子生物学技术，从铜绿假单胞菌标准株ATCC27853和铜绿假单胞菌水貂分离株DL9基因组中获得外膜蛋白OprF190-342和OprI21-83的基因，并通过融合PCR的方法将其融合在一起。利用DNAStar、DNAMAN和多个生物学网站对其进行生物信息学分析。OprF190-342-OprI21-83基因的核苷酸序列在铜绿假单胞菌不同菌株间高度保守；蛋白成亲水性，二级结构主要以α螺旋为主。随后综合多种有利于直接表达具有活性重组蛋白的条件，在大肠杆菌表达系统中成功可溶性表达铜绿假单胞菌标准株ATCC27853的外膜蛋白OprF190-342-OprI21-83（FI），利用凝血酶去除其载体上的GST标签，实现无标签蛋白FI的可溶性表达。 巨噬细胞和树突细胞等免疫细胞表面都具有丰富甘露糖受体（MMR）的表达，用甘露糖修饰载体，则能通过受体介导的吞噬作用，来提高细胞对于药物的摄取。因此，本研究以甘露糖和壳聚糖为材料，在氰基硼氢化钠的催化下，使甘露糖的羧基与壳聚糖的氨基发生缩合反应，将甘露糖修饰到壳聚糖上，获得甘露糖修饰的壳聚糖衍生物。以已获得的铜绿假单胞菌外膜融合蛋白FI为模式抗原，采用离子凝聚法和复乳法成功制备了含有抗原FI的壳聚糖微球载体疫苗（FI-CS-MPs）、甘露糖修饰的壳聚糖微球载体疫苗（FI-MCS-MPs）、壳聚糖包衣的PLGA微球载体疫苗（FI-CP-MPs）和甘露糖修饰的壳聚糖包衣的PLGA微球载体疫苗（FI-MCP-MPs）。并通过扫描电镜、粒径测定仪、BCA蛋白浓度测定等方法对这四种生物可降解多糖微球载体疫苗的表征进行了检测。结果显示四种微球疫苗均成正球体，形态规则，分散性良好，表面不光滑成粗糙状态，，无褶皱；平均粒径大小都在2~3μm；包封率与载药量良好；在体外抗原释放实验中，可降解多糖微球载体疫苗在最初的12小时内释放出约30%~50%的抗原FI，并且经过甘露糖修饰的微球载体疫苗的释放率始终高于未经甘露糖修饰的微球载体疫苗。 以获得的四种可降解多糖微球载体疫苗为基础，将模式抗原FI标记上FITC荧光，通过流式细胞术和激光共聚焦两种免疫学技术，比较小鼠巨噬细胞RAW264.7对这四种可降解多糖微球载体疫苗的摄取情况。结果显示，小鼠巨噬细胞RAW264.7对含有FITC-FI的微球载体疫苗的摄取率比游离的FITC-FI显著增高；且对甘露糖修饰的微球载体疫苗摄取率最高，显著高于对照组。通过免疫荧光和免疫组化的方法，体内外均成功验证经过甘露糖修饰的微球载体疫苗可以靶向小鼠巨噬细胞RAW264.7和小鼠NALT组织上的巨噬细胞甘露糖受体。 本研究利用小鼠巨噬细胞RAW264.7和NF-κB和MAPK信号通路试剂盒，通过Western-blot方法，揭示生物可降解多糖微球载体疫苗可以显著激活小鼠巨噬细胞RAW264.7NF-κB和MAPK信号通路。并且经过甘露聚糖抑制甘露糖受体，甘露糖修饰的壳聚糖微球载体疫苗激活这两条信号通路的现象明显消失。 用获得的生物可降解多糖微球载体疫苗滴鼻免疫BALB/c小鼠，间接ELISA和流式细胞术检测免疫后各个时间点小鼠黏膜和系统体液特异性抗体水平和T淋巴细胞亚型情况。结果显示，在体液水平方面，最先检测到的抗体为肺脏研磨液中的FI特异性IgM，随着免疫时间的延续其抗体效价逐渐减少；在鼻腔灌洗液和支气管灌洗液中，甘露糖修饰的壳聚糖微球组特异性IgA抗体效价在免疫初期显著高于对照组；并且在滴鼻免疫的远端黏膜部位小肠灌洗液中，与对照组相比甘露糖修饰的壳聚糖微球组特异性IgA抗体水平也显著增高；在激活黏膜部位抗体水平的同时，在血清中的特异性IgA和IgG水平也显著增高，甘露糖修饰的壳聚糖微球组显著高于对照组。肺脏、小肠派尔氏结和脾脏中，甘露糖修饰的壳聚糖微球组的T淋巴细胞亚型CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+均显著升高，并伴随细胞培养上清液中IL-4和IFN-γ的显著表达，提示甘露糖修饰的微球疫苗呈现混合Th1/Th2反应。生物可降解多糖微球载体疫苗可以显著提高最小致死量铜绿假单胞菌攻毒小鼠的存活率。 在BALB/c小鼠体内，生物降解多糖微球载体疫苗具有良好的滴鼻免疫效果，随后本研究通过间接ELISA和HE染色组织学观察等方法，研究其在本体动物水貂中滴鼻黏膜免疫后，抗体水平的变化情况，评价其免疫效果。结果显示，甘露糖修饰的微球疫苗组在免疫初期的血清IgG抗体水平显著高于对照组，且持续到免疫观察末期。壳聚糖微球载体疫苗可以显著提高铜绿假单胞菌攻毒水貂的存活率，FI-CS-MPs、FI-CP-MPs、FI-MCS-MPs和FI-MCP-MPs组水貂的存活率分别是62.5%、62.5%、75%和62.5%，但由于实验过程中的攻毒过程为急性感染，所以甘露糖修饰的壳聚糖微球疫苗组存活率与未经甘露糖修饰的壳聚糖微球疫苗组存活率无显著差异。组织学观察，壳聚糖微球载体疫苗可以显著减轻铜绿假单胞菌攻毒水貂肺脏和脾脏的炎症反应。 总之，本研究成功制备含有铜绿假单胞菌外膜融合蛋白FI的经过甘露糖修饰的壳聚糖可生物降解微球载体疫苗（FI-MCS-MPs和FI-MCS-MPs）。体内外验证其可以靶向巨噬细胞甘露糖受体。经过BALB/c小鼠和本体动物水貂滴鼻免疫以后，显示与对照组相比其可以较早的显著增强黏膜和系统体液及细胞免疫应答，呈现混合Th1/Th2反应。对铜绿假单胞菌攻击的小鼠和水貂具有很好的保护率。因此，甘露糖修饰的壳聚糖可生物降解微球载体是一个很有潜力的可生物降解滴鼻黏膜免疫疫苗载体。为生物可降解多糖微球载体疫苗在水貂等经济毛皮动物中的应用提供可靠的理论和实验依据。
【关键词】：铜绿假单胞菌 生物降解 微球疫苗 甘露糖受体 黏膜免疫 壳聚糖
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.4
【目录】：

• 中文摘要5-8
• Abstract8-18
• 英文缩写词表18-19
• 引言19-21
• 第一篇 文献综述21-45
• 第一章 甘露糖受体靶向传递系统的研究进展21-27
• 1.1 甘露糖受体概况21-24
• 1.1.1 甘露糖受体类型21-23
• 1.1.2 甘露糖受体的多聚化和亲和力23-24
• 1.2 甘露糖受体对抗原的摄取与递呈24-25
• 1.3 甘露糖受体的免疫激活25
• 1.4 甘露糖受体的靶向疫苗相关研究25-27
• 第二章 生物降解材料简述27-33
• 2.1 壳聚糖27-29
• 2.1.1 壳聚糖基本性质27-28
• 2.1.2 离子凝聚法制备壳聚糖微球28-29
• 2.2 PLGA29-31
• 2.2.1 PLGA 基本性质29-30
• 2.2.2 PLGA 疫苗相关研究30-31
• 2.3 壳聚糖和 PLGA 的吸附静电作用31-33
• 第三章 鼻黏膜免疫微球载体疫苗33-39
• 3.1 鼻黏膜免疫的特点33-35
• 3.1.1 鼻黏膜免疫的优点33-35
• 3.1.2 鼻黏膜免疫的缺点35
• 3.2 鼻黏膜免疫壳聚糖载体疫苗近期研究进展35-36
• 3.3 黏膜免疫甘露糖修饰的壳聚糖载体疫苗近期研究进展36-39
• 第四章 铜绿假单胞菌疫苗研究进展39-45
• 4.1 脂多糖（LPS）和 O-多糖疫苗39-41
• 4.2 粘液胞外多糖疫苗41
• 4.3 鞭毛疫苗41-42
• 4.4 菌毛疫苗42-43
• 4.5 外膜蛋白疫苗43-45
• 第二篇 研究内容45-145
• 第一章 重组抗原铜绿假单胞菌外膜蛋白 OprF190 342-OprI21 83基因克隆、表达及生物信息学分析45-69
• 1.1 材料45-47
• 1.1.1 菌株和表达载体45-46
• 1.1.2 主要试剂46
• 1.1.3 仪器和设备46
• 1.1.4 试剂的配制46-47
• 1.2 方法47-54
• 1.2.1 铜绿假单胞菌外膜蛋白 OprF190 342-OprI21 83基因克隆表达与鉴定47-53
• 1.2.2 铜绿假单胞菌外膜蛋白 OprF190 342-OprI21 83核酸及蛋白序列的生物信息学分析53-54
• 1.3 结果54-66
• 1.3.1 铜绿假单胞菌外膜蛋白 OprF190 342-OprI21 83基因克隆表达与鉴定54-59
• 1.3.2 铜绿假单胞菌外膜蛋白 OprF190 342-OprI21 83基因及蛋白序列生物信息学分析59-66
• 1.4 讨论66-68
• 1.5 小结68-69
• 第二章 生物可降解多糖微球载体疫苗的制备及体外评价69-83
• 2.1 材料70-71
• 2.1.1 主要药品和试剂70
• 2.1.2 仪器和设备70
• 2.1.3 试剂的配制70-71
• 2.2 方法71-74
• 2.2.1 甘露糖修饰的壳聚糖衍生物的制备71
• 2.2.2 壳聚糖和甘露糖修饰的壳聚糖微球载体疫苗的制备及体外评价71-72
• 2.2.3 壳聚糖和甘露糖修饰的壳聚糖包衣的 PLGA 微球载体疫苗的制备及体外评价72-73
• 2.2.4 数据的统计与分析73-74
• 2.3 结果74-80
• 2.3.1 甘露糖修饰的壳聚糖衍生物的获得74
• 2.3.2 壳聚糖和甘露糖修饰的壳聚糖微球载体疫苗的表征74-77
• 2.3.3 壳聚糖和甘露糖修饰的壳聚糖包衣的 PLGA 微球载体疫苗的表征77-80
• 2.4 讨论80-81
• 2.5 小结81-83
• 第三章 生物可降解多糖微球载体疫苗在巨噬细胞中的摄取及其靶向性研究83-95
• 3.1 材料83-85
• 3.1.1 实验细胞株和动物83
• 3.1.2 主要药品和试剂83-84
• 3.1.3 仪器和设备84
• 3.1.4 试剂的配制84-85
• 3.2 方法85-88
• 3.2.1 生物可降解多糖微球载体疫苗在巨噬细胞中的摄取85-86
• 3.2.2 FI-MCS-MPs 和 FI-MCP-MPs 靶向巨噬细胞甘露糖受体研究86-88
• 3.2.3 数据的统计与分析88
• 3.3 结果88-92
• 3.3.1 生物可降解多糖微球载体疫苗在巨噬细胞中的摄取88-90
• 3.3.2 FI-MCS-MPs 和 FI-MCP-MPs 靶向巨噬细胞甘露糖受体研究90-92
• 3.4 讨论92-94
• 3.5 小结94-95
• 第四章 巨噬细胞甘露糖受体介导甘露糖修饰的多糖微球载体疫苗促进 MAPK 和 NF-κB 信号通路的活化95-115
• 4.1 材料95-97
• 4.1.1 实验细胞株95-96
• 4.1.2 主要药品和试剂96
• 4.1.3 仪器和设备96
• 4.1.4 试剂的配制96-97
• 4.2 方法97-99
• 4.2.1 小鼠巨噬细胞 RAW264.7 的培养97-98
• 4.2.2 MTT 方法检测生物可降解多糖微球载体疫苗对小鼠巨噬细胞 RAW264.7 的毒性作用98
• 4.2.3 巨噬细胞分泌细胞因子的测定98
• 4.2.4 信号通路细胞蛋白的提取及 Western blot 检测98-99
• 4.2.5 信号通路蛋白 Western blot 检测99
• 4.2.6 数据的统计与分析99
• 4.3 结果99-111
• 4.3.1 生物可降解多糖微球载体疫苗对小鼠巨噬细胞 RAW264.7的毒性作用99-101
• 4.3.2 生物可降解多糖微球载体疫苗对巨噬细胞细胞因子分泌的影响101-103
• 4.3.3 生物可降解多糖微球载体疫苗对小鼠巨噬细胞 RAW264.7NF-κB 信号转导通路的影响103-107
• 4.3.4 物可降解多糖微球载体疫苗对小鼠巨噬细胞 RAW264.7MAPK 信号转导通路的影响107-111
• 4.4 讨论111-112
• 4.5 小结112-115
• 第五章 生物可降解多糖微球载体疫苗在小鼠中的黏膜免疫效果评价及安全性效力评价115-137
• 5.1 材料116
• 5.1.1 实验动物和菌株116
• 5.1.2 主要药品和试剂116
• 5.1.3 仪器和设备116
• 5.1.4 试剂的配制116
• 5.2 方法116-120
• 5.2.1 实验动物免疫程序116-117
• 5.2.2 黏膜和系统体液免疫应答的影响117-119
• 5.2.3 黏膜和系统中 T 淋巴细胞亚群水平的影响119
• 5.2.4 肺脏脾脏 T 淋巴细胞培养上清 IFN-γ和 IL-4 细胞因子测定119-120
• 5.2.5 生物可降解多糖微球载体疫苗对小鼠攻毒保护效果研究120
• 5.2.6 数据的统计与分析120
• 5.3 结果120-132
• 5.3.1 黏膜和系统体液免疫应答的影响120-125
• 5.3.2 黏膜和系统中 T 淋巴细胞亚群水平的影响125-130
• 5.3.3 肺脏脾脏淋巴细胞培养上清 IFN-γ和 IL-4 细胞因子测定130-131
• 5.3.4 生物可降解多糖微球载体疫苗对小鼠攻毒保护效果研究131-132
• 5.4 讨论132-134
• 5.5 小结134-137
• 第六章 生物可降解多糖微球载体疫苗在水貂中的黏膜免疫效果评价及安全性效力评价137-145
• 6.1 材料138
• 6.1.1 实验动物和菌株138
• 6.1.2 主要药品和试剂138
• 6.1.3 仪器和设备138
• 6.1.4 试剂的配制138
• 6.2 方法138-140
• 6.2.1 实验动物免疫程序138-139
• 6.2.2 血清中 FI 特异性抗体的检测139
• 6.2.3 生物可降解多糖微球载体疫苗对水貂攻毒保护效果研究139-140
• 6.2.4 数据的统计与分析140
• 6.3 结果140-142
• 6.3.1 血清中 FI 特异性抗体的检测140-141
• 6.3.2 生物可降解多糖微球载体疫苗对水貂攻毒保护效果研究141-142
• 6.4 讨论142-144
• 6.5 小结144-145
• 结论145-146
• 创新点146-147
• 参考文献147-163
• 导师简介163-164
• 个人简介164-165
• 在学期间所取得的科研成果165-166
• 致谢166

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 李建秀,俞镇慌;完全生物降解材料的应用及发展趋势[J];产业用纺织品;2003年09期

2 阳兵;赵凌云;徐小雨;王晓文;张晓东;高福平;唐劲天;;磁流体联合药物缓释载体介导的肿瘤磁感应热化疗[J];科技导报;2010年14期

3 马晓东;章文斌;周定标;;BCNU缓释微球制备条件的优化[J];中华神经外科疾病研究杂志;2006年04期

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