ORFV感染宿主细胞的mRNA表达谱变化及其诱导细胞自噬机制的研究

发布时间：2017-06-30 07:15

  本文关键词：ORFV感染宿主细胞的mRNA表达谱变化及其诱导细胞自噬机制的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：羊传染性脓疱病毒（Orf virus，ORFV）是痘病毒科副痘病毒属的代表种，具有嗜上皮性，绵羊、山羊以及人发生感染后通常在口、唇等部位皮肤出现丘疹、脓疱等损伤性病变，因此该病又俗称为“羊口疮”（Orf）。Orf作为一种人兽共患传染病，，对人类的健康构成了严重威胁。目前，该病的发生、流行均呈上升趋势。宿主感染谱也在逐渐扩大，除感染中小反刍动物外，也不断有野生动物发生感染的报道。近年来，研究者对ORFV的基因组结构、免疫特性以及载体应用等方面进行了大量的研究；然而，目前仍没有有效预防和治疗羊传染性脓疱病的方法和措施。 病毒的感染和致病是一个非常复杂的过程，病毒侵染宿主后能够引起易感细胞的一些调控基因差异表达及其所介导信号通路改变，造成细胞生理功能异常从而导致疾病的发生。因此，本项目从病毒与宿主相互作用的角度入手，利用Illumina/Solexa测序技术构建羊源原代胚胎鼻甲（ovine fetal turbinate，OFTu）细胞感染ORFV后48h和96h的mRNA表达谱，进行差异表达基因的筛选。在感染病毒后48h，筛选得到了1047个表达上调基因，366个表达下调基因；在感染病毒后96h，有1570个基因表达上调，982个基因表达下调；GO分析结果表明，差异基因参与的分子功能主要有催化活性、结合活性、酶调节活性、分子转导活性和蛋白结合转录因子活性等；参与的生物学过程主要有免疫过程、生物调节过程、代谢过程和应激反应等。Pathway分析结果显示，所筛选得到的差异表达基因主要参与炎症、免疫、细胞自噬以及细胞凋亡等相关通路。该部分研究结果将为针对ORFV与宿主互作研究的开展提供重要的理论依据，并为进一步揭示ORFV致病的分子机制奠定基础。 近年来，许多研究已经证实自噬和病毒感染之间具有直接的作用关系。然而，ORFV是否能够诱导细胞自噬却并未见有报道。我们前期研究对ORFV感染前后差异表达基因进行了筛选鉴定，生物信息学分析发现了与细胞自噬相关的差异表达基因如自噬标志性分子LC3表达上调。细胞自噬是机体一种非常重要的保护和防御机制，能够将受损细胞器、胞质内容物进行循环再利用，为细胞提供合成底物和能量来维持细胞稳态。因此，我们选择在生理和病理以及先天性免疫和获得性免疫过程中发挥重要作用的自噬作为研究方向。本研究在ORFV感染OFTu细胞或Hela细胞后，利用透射电镜、间接免疫荧光和免疫印迹分别进行了自噬体形态学观察、内源性LC3的定位以及LC3的型别转换的检测；结果发现，ORFV能够诱导OFTu细胞和Hela细胞自噬体的形成。因为自噬是一个动态过程不仅包括自噬体的形成，而且还包括自噬体与溶酶体融合运送被降解物到自噬溶酶体降解的过程。因此我们又进一步通过免疫印迹对自噬底物SQSTMl/p62进行了检测；结果显示，ORFV感染宿主细胞（OFTu细胞和Hela细胞）后能够诱导自噬体和溶酶体融合进而降解自噬底物。 在证实ORFV能够诱导宿主细胞发生完整的自噬过程后，本研究用自噬诱导剂（Rapa或EBSS）以及自噬不同时期（早期抑制剂3-MA和晚期抑制剂CQ）的抑制剂处理宿主细胞后，接种ORFV，利用免疫印迹对LC3的型别转换进行了检测。在有效诱导或抑制自噬后，检测ORFV的感染滴度。结果发现，诱导自噬或抑制自噬后，ORFV的感染滴度并未发生明显变化。这可能是宿主在ORFV入侵时激活了自噬过程进行自我保护，而ORFV可能也会编码一些蛋白来逃避或抵御宿主抗病毒反应。 为了进一步明确ORFV感染诱导宿主细胞自噬的机制。本研究在ORFV感染细胞或Rapamycin处理细胞后，提取细胞总蛋白，进行了免疫印迹分析；结果显示，ORFV感染组以及Rapamycin处理组的mTOR的磷酸化水平降低，而LC3-Ⅱ的表达量显著升高，说明mTOR信号途径在ORFV诱导细胞自噬过程中具有重要的作用。为了进一步验证mTOR途径的抑制是ORFV诱导自噬的关键步骤，我们对Rheb基因进行定点突变后构建了能够激活mTOR活性的Rheb激活形式：pCMV-myc-Rheb Q64L过表达载体。将pCMV-myc-Rheb Q64L转染细胞后，进行免疫印迹分析；结果显示，转染Rheb Q64L后mTOR的磷酸化水平明显升高，而LC3-Ⅱ表达量下降；说明Rheb Q64L恢复了mTOR的活性。在证实ORFV能够通过抑制mTOR途径诱导细胞自噬后，我们对mTOR上游的Erk1/2和TSC2的表达变化进行了检测，发现ORFV能够激活TSC2和Erk1/2的活性。用U0126（Erk1/2抑制剂）处理Hela细胞后，接种病毒，免疫印迹分析mTOR、Erk1/2以及TSC2的磷酸化水平；结果显示，p-Erk1/2和LC3-Ⅱ的表达量明显被抑制，而mTOR的磷酸化水平显著升高，同时，p-TSC2也被抑制。之后，我们将设计合成的3对靶向TSC2的siRNA（siTSC2-1，siTSC2-2和siTSC2-3）转染细胞，发现siTSC2-1，siTSC2-2和siTSC2-3的抑制效率分别为73.4%、65.4%和93.1%。将siTSC2-3转染细胞后，接种病毒，免疫印迹分析p-mTOR、p-TSC2以及p-Erk1/2的表达变化；结果发现，TSC2的磷酸化水平和LC3-Ⅱ的表达量降低，p-mTOR发生上调，而p-Erk1/2未出现明显变化。以上结果说明ORFV感染宿主后能够通过激活Erk1/2，使TSC2活化，进而抑制了mTOR的活性，最终诱导自噬的发生。以上研究结果将为进一步研究ORFV的感染特性和分子致病机制奠定了基础。
【关键词】：羊传染性脓疱病毒 mRNA表达谱 自噬 信号转导
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-10
• 目录10-12
• 英文缩略词12-14
• 前言14-16
• 第一篇 文献综述16-36
• 第1章 羊传染性脓疱病毒研究进展16-26
• 1.1 ORFV发现简史16
• 1.2 ORFV 基因组16-18
• 1.3 ORFV 免疫机制18-20
• 1.4 ORFV致病机制20-23
• 1.5 ORFV载体应用23-24
• 1.6 小结24-26
• 第2章 自噬的研究进展26-36
• 2.1 自噬的基本过程26-27
• 2.2 自噬类型27-28
• 2.3 自噬的信号调节28-29
• 2.4 两种蛋白降解途径29-31
• 2.5 病毒与自噬的相互作用31-33
• 2.6 小结33-36
• 第二篇 研究内容36-110
• 第1章 ORFV 感染宿主细胞的差异表达基因筛选和分析36-60
• 1.1 材料36-39
• 1.2 方法39-41
• 1.3 结果41-55
• 1.4 讨论55-58
• 1.5 小结58-60
• 第2章 ORFV 感染诱导宿主细胞自噬60-76
• 2.1 材料60-64
• 2.2 方法64-67
• 2.2.1 透射电镜观察64
• 2.2.2 间接免疫荧光观察64-65
• 2.2.3 免疫印迹65-66
• 2.2.4 统计分析66-67
• 2.4 结果67-72
• 2.5 讨论72-74
• 2.6 小结74-76
• 第3章 细胞自噬对羊传染性脓疱病毒复制的影响76-86
• 3.1 材料76-78
• 3.2 方法78-80
• 3.3 结果80-83
• 3.3.1 Rapamycin 或 EBSS 诱导细胞自噬80
• 3.3.2 3 -MA 或 CQ 抑制细胞自噬80-81
• 3.3.3 诱导或抑制自噬对 ORFV 复制的影响81-82
• 3.3.4 不同药物对细胞毒性的检测结果82-83
• 3.4 讨论83-84
• 3.5 小结84-86
• 第4章 ORFV 感染诱导细胞自噬的机制研究86-110
• 4.1 材料86-89
• 4.2 方法89-96
• 4.3 结果96-106
• 4.4 讨论106-108
• 4.5 小结108-110
• 结论110-112
• 参考文献112-130
• 导师简介130-132
• 攻读博士期间发表的学术论文132-133
• 致谢133

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 王光祥;尚佑军;陈江涛;吕占禄;张克山;刘湘涛;;湖北省羊口疮病毒的分离鉴定[J];动物医学进展;2012年11期

2 田婷婷;李杰;姚运亮;李前瑞;许君艳;赵燕青;陈德坤;;羊口疮病毒灭活疫苗的制备及免疫效果观察[J];动物医学进展;2013年06期

3 柯丹霞;印遇龙;;小G蛋白对mTOR信号通路的调控[J];动物营养学报;2013年08期

4 侯丽颖;孙燕佩;张旭光;赵栋;吴坤;;维生素E琥珀酸酯通过Akt/mTOR信号通路诱导人胃癌细胞SGC-7901发生保护性自噬[J];癌变.畸变.突变;2013年05期

5 程玉;李春辉;;胃癌中Cx43与PI3K/Akt/mTOR信号通路相关性的研究进展[J];承德医学院学报;2013年05期

6 陈松峰;邵增务;;自噬相关信号转导通路研究进展[J];国际骨科学杂志;2013年04期

7 白刚;贾怀杰;何小兵;景志忠;;痘病毒宿主范围因子及其作用机制研究进展[J];病毒学报;2013年06期

8 Yu-Shan Chen;Xiao-Bo Qiu;;Ubiquitin at the crossroad of cell death and survival[J];Chinese Journal of Cancer;2013年12期

9 林松;范磊;邵增务;;微RNA调控自噬研究进展[J];国际骨科学杂志;2013年05期

10 郑溜丰;彭健;;中枢神经系统整合外周信号调节采食量的分子机制[J];动物营养学报;2013年10期

中国重要会议论文全文数据库 前4条

1 张克山;刘永杰;成伟伟;尚佑军;逯忠新;刘湘涛;;羊传染性脓疱病毒逃避宿主免疫应答的机制[A];中国畜牧兽医学会养羊学分会2014年全国养羊生产与学术研讨会议论文集[C];2014年

2 鲁倩倩;陈同洋;秦鹏钧;姜学军;;真菌次级代谢产物Rasfonin(A304)引起细胞死亡机理研究[A];中国菌物学会第六届会员代表大会（2014年学术年会）暨贵州省食用菌产业发展高峰论坛会议摘要[C];2014年

3 薛玉;刘毅;张旭霞;ZHANG Jun-jie;李传友;;结核病与Parkin蛋白[A];科学研究与结核病防治高峰论坛论文汇编[C];2014年

4 孟韬;马兰萍;于霆;王昕;余科;沈竞康;;mTOR激酶抑制剂SCC-31的临床前研究[A];第十二届全国青年药学工作者最新科研成果交流会论文集[C];2014年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 郭良兴;吉林省羊传染性脓疱病流行病学调g�及其灭活疫苗的研制[D];吉林大学;2012年

2 张力;单组分纳米材料在癌症诊断和细胞自噬介导的癌症治疗中的应用研究[D];中国科学技术大学;2013年

3 郑慧芬;自噬在系统性炎症所致黑质多巴胺神经元损伤中的作用及机制研究[D];苏州大学;2013年

4 杨爱民;Neuronostatin对痛觉、胃肠运动和情绪的影响及脂基化蛋白LC3-Ⅱ的半合成[D];兰州大学;2013年

5 黄星;凋亡抑制蛋白XIAP抑制自噬促进肿瘤形成的作用机制研究[D];中国科学技术大学;2013年

6 王振波;LC3A在食管鳞癌中的放化疗敏感性预测作用[D];山东大学;2013年

7 刘峗;调控镊钴基纳米材料及纳米基因载体的自噬效应在肿瘤诊疗中的应用[D];中国科学技术大学;2013年

8 成娟;自噬在白血病K562/ADM细胞多药耐药性及三氧化二砷抗白血病效应中的作用[D];兰州大学;2013年

9 沈薇;卵巢衰老相关基因的功能验证和机制探讨[D];华中科技大学;2013年

10 高丽;血管紧张素-（1-7）在高血压及脑缺血损伤中的作用及机制研究[D];南京医科大学;2013年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 张海瑞;羊口疮病毒的分离鉴定及其ELISA检测方法的建立[D];中国农业科学院;2011年

2 罗云;羊传染性脓疱病毒生物学特性及PCR检测方法的研究[D];内蒙古农业大学;2006年

3 王辉;羊传染性脓疱病毒F1L基因克隆、序列分析及核酸探针的研究[D];内蒙古农业大学;2007年

4 王改丽;RNAi抑制羊传染性脓疱病毒增殖效果的研究[D];吉林大学;2012年

5 张绍进;泛素激活酶Ubal对细胞自噬的调节机理研究[D];华中农业大学;2012年

6 魏芳;ApoG2对乳腺癌MCF-7细胞放射增敏作用及与紫杉醇联合应用协同效应的实验研究[D];南方医科大学;2012年

7 苏高莉;羊传染性脓疱病毒农安株的分离鉴定及其免疫原蛋白的表达与纯化[D];吉林大学;2013年

8 齐赫;二甲双胍对贡氏假鳃溕寿命、行为学、代谢及组织学衰老指标的影响[D];山东师范大学;2013年

9 尚斌;抑制自噬对内皮祖细胞促进静脉血栓机化再通的影响的实验研究[D];苏州大学;2013年

10 陈露;基质细胞Cav-1表达影响骨髓瘤细胞对蛋白酶体抑制剂的敏感性[D];苏州大学;2013年

  本文关键词：ORFV感染宿主细胞的mRNA表达谱变化及其诱导细胞自噬机制的研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：501080